Преаналитический этап лабораторной диагностики микозов

С учетом потенциальной опасности взятие любого исследуемого в лаборатории биологического материала следует проводить с применением правил асептики.

Сбор материала

КОЖА

Сбор материала с кожных поражений проводят с помощью соскоба, мазка, отпечатка липкой лентой. Предварительно следует обработать пораженное место тампоном, смоченным 70% этиловым спиртом, особенно если на этот участок кожи были нанесены крем, пудра или иные косметические препараты. Такая обра­ботка позволяет уменьшить контаминацию исследуемого материала посторонней бактериальной флорой

•  Соскоб — наиболее частый способ сбора материала с кожи. Для соскоба при­меняют тупые скальпели, кюретки (во избежание травм кожи), предметное стекло. Взятие материала оптимально проводить с наружного края пораже­ний, так как здесь наиболее высоко содержание жизнеспособных, активно размножающихся грибов. В случае пузырных высыпаний необходимо взять для исследования покрышки свежих пузырьков, пузырей, обрывки мацерированного эпидермиса.
•  Мазок берут с участков кожи в области естественных складок, с мацерированных очагов, при выраженном воспалении. Взятие материала проводят стерильным тампоном, смоченным водой, физиологическим раствором или жидкой питательной средой.
•  Отпечаток с помощью липкой ленты применяют при отсутствии видимого и скрытого шелушения патологического кожного очага. Прозрачную липкую ленту прижимают к очагу, затем удаляют и кладут липкой стороной на пред­метное стекло, тщательно расправляя ее.

Собранные методом соскоба чешуйки кожи помещают в чашки Петри для транс­портирования соскобов с маркировкой дна чашки и доставляют в лабораторию.

НОГТЕВЫЕ ПЛАСТИНКИ

Перед взятием материала поверхность ногтя обрабатывают тампоном, смочен­ным 70% этиловым спиртом. Сбор материала проводят скальпелем, лезвием брит­вы, маникюрными ножницами, кусачками, бором или фрезой бормашины.

При поверхностной форме онихомикоза делают соскобы с пораженной части ногтевой пластинки до здоровых слоев ногтя, не пораженных грибом. Оптимально использовать для анализа средние слои ногтевой пластины.

При локализации патологического процесса в дистально-латеральных зонах ногтя для исследования берут срезы ногтевой пластинки. Желательно делать срез во всю толщу ногтя и наиболее далеко от его свободного края. Кроме того, необ­ходимо исследовать подногтевые роговые гиперкератотические массы, по воз­можности захватывая наиболее проксимальные и глубокие слои. Поверхностные слои соскобов ногтевых пластин и гиперкератотических масс не используются в исследовании из-за высокой контаминации бактериальной микрофлорой.

В случае подногтевой локализации очага в проксимальной части ногтевой пла­стинки взятие материала проводят бормашиной. Ногтевую пластинку просверли­вают бором. Образующуюся пыль собирают с помощью отсоса.

ВОЛОСЫ

Перед взятием материала проводят выбор очага с помощью лампы Вуда. Волосы эпилируют пинцетом. Коротко обломанные волосы из очагов можно извлечь иглой. При фавусе взятие волоса проводят из центра скутулы, при микроспории, инфильтративно-нагноительной трихофитии — с периферии очага.

Собранный материал (соскобы и срезы ногтевых пластинок, волосы) помещают в стерильные чашки Петри с маркировкой дна и транспортируют в лабораторию.

ЯЗВЫ ВАРИКОЗНЫЕ, ИШЕМИЧЕСКИЕ И ДИАБЕТИЧЕСКИЕ. ПРОЛЕЖНИ

Мазок с поверхности раны существенно менее информативен, чем проба, аспирированная шприцем.

Материал получают следующим образом:

• очищают поверхность раны стерильной салфеткой, смоченной стерильной дистиллированной водой;
• используя лезвие скальпеля, получают соскоб с периферической границы раны.

Помещают материал в стерильный контейнер с завинчивающейся крышкой или специально смонтированную стерильную стеклянную емкость, причем для предо­хранения пробы от высыхания добавляют в емкость 1-3 капли дистиллированной воды и сразу же передают пробу в лабораторию.

СЛИЗИСТЫЕ ОБОЛОЧКИ

Полость рта

Сбор проб со слизистой оболочки ротовой полости проводят утром натощак до приема пищи после полоскания рта теплой кипяченой водой. Взятие материала проводят с помощью стерильных влажных тампонов соскобами с пораженной поверхности. Пленки и налеты со слизистой оболочки снимают стерильной лож­кой Фолькмана, стоматологическим шпателем или бактериологической петлей.

Слизистые оболочки урогенитального тракта

При воспалительной симптоматике урогенитального тракта образец из уретры у мужчин берут бактериологической петлей объемом 1 мкл либо дакроновой щет­кой/тампоном; при выделениях из уретры поверхность головки полового члена и область наружного отверстия уретры должны быть очищены с помощью марле­вого тампона, крайняя плоть отведена назад для предупреждения контаминации. При отсутствии свободных выделений необходимо попросить пациента слегка помассировать уретру скользящими движениями от основания пениса к его голов­ке. После введения пластиковой петли в уретру на 1-2 см необходимо плоскость «глазка» петли двигать к отверстию, слегка нажимая на стенки уретры. Не реко­мендуют вращать петлю во время процедуры взятия образца в связи с болезнен­ностью этой манипуляции для пациента. Образец из препуциального мешка берут дакроновым тампоном.

У женщин на исследование берут соскобы из уретры, цервикального канала, с заднего и боковых сводов влагалища, свободно стекающие выделения из заднего свода влагалища. Для получения проб со слизистых оболочек уретры, влагалища (заднего свода), цервикального канала рекомендуют использовать одноразовый стерильный инструментарий: уретральный пропиленовый зонд с синтетическим ворсом — «сваб» (вискозой или дакроном), а также специальные щеточки- браши — cervix brush и vota brush. Для получения полноценного материала из шейки матки рекомендуют использовать одноразовый стерильный инструментарий, например шпатель Айре; для беременных, женщин в менопаузе и после конизации шейки матки — специальные браши. представляющие собой щеточки с множе­ственными щетинками, расположенными по спирали.

После обнажения шейки матки в зеркалах тщательно очищают шейку от секре­тов вагины и слизи с помощью ватного тампона, смоченного стерильным физио­логическим раствором или стерильной водой. После этого щеточку (стерильный зонд-тампон, или зонд-тампон транспортного коллектора со средой) осторожно вводят в цервикальный канал на глубину 1,0-1,5 см, не касаясь стенок влагалища. Вращая любой из перечисленных выше инструментов несколько раз вокруг оси, захватывают материал — клетки, экссудат по периметру цервикального канала.

Сбор пробы из уретры у женщин осуществляют через 1 или 2 ч после мочеи­спускания. Стимулируют образование отделяемого легким массажем уретры через влагалище, собирают образовавшееся отделяемое стерильным зондом-тампоном.

Соскобы слизистой оболочки пищевода проводят при фиброгастродуоденоскопии.

МОКРОТА

Сбор мокроты проводят утром сразу же после пробуждения, натощак. Пациент должен предварительно почистить зубы и прополоскать полость рта кипяченой водой, что позволяет механически удалить основную часть вегетирующей в рото­вой полости микрофлоры и остатки пищи. Предупреждают больного, чтобы он не собирал в контейнер слюну или носоглоточное отделяемое. Пациенту предлагают глубоко прокашляться; если кашель сухой, непродуктивный, можно попытаться стимулировать появление мокроты с помощью ингаляций.

Если же пациент не выделяет мокроту или выделяет ее только эпизодически и в скудном количестве, накануне вечером и рано утром в день сбора мокроты сле­дует дать ему отхаркивающее средство или применить раздражающие ингаляции. Последние провоцируют усиление секреции бронхов, кашель и отделение мокро­ты. Собранный таким образом материал не подлежит консервации, поэтому при­готовление мазков из такого материала необходимо проводить в день его сбора.

Для аэрозольных ингаляций используют портативные или стационарные аэрозольные ингаляторы. Для ингаляции рекомендуют использовать раствор, в 1 л которого содержится 150 г натрия хлорида (NaCl) и 30 г натрия бикарбо­ната (Na₂С0₃). Для предотвращения загрязнения раствора кислотоустойчивыми сапрофитами, которые нередко содержатся в водопроводной воде и могут при­вести при микроскопическом исследовании к получению ложноположительного результата, используют дистиллированную воду. Для провокации выделения мокроты необходимо вдохнуть от 30 до 60 мл подогретого до 42-45 °С физиологического раствора. Продолжительность ингаляции должна составлять не менее 10-15 мин.

Поскольку вдыхаемый во время ингаляции раствор вызывает усиленную сали­вацию еще до появления кашля и отделения мокроты, в первые минуты после завершения процедуры пациент должен сплюнуть слюну в специально приготов­ленный лоток с 5% раствором хлорамина или другого дезинфицирующего сред­ства и только после этого собра гь мокроту для исследования. В связи с тем что аэрозольная ингаляция вызывает выделение водянистого секрета, напоминающе­го по консистенции слюну, во избежание выбраковки материала в направлении и на флаконе с материалом должна быть обязательная маркировка, указывающая на то, что материал получен после аэрозольной ингаляции.

Образцы мокроты должны быть исследованы не позднее 2 ч после сбора. Допускается хранение образцов в холодильнике при 4 °С. Суточная мокрота не подлежит микологическому исследованию из-за быстрой контаминации бактери­альной микрофлорой.

БРОНХОАЛЬВЕОЛЯРНЫЙ ЛАВАЖ

Сбор лаважной жидкости проводят при промывании бронхов с помощью фибробронхоскопа. Шприцем вводят через биопсийный канал бронхоскопа отдельными порциями стерильный небактериостатический (официнальный) физиологический раствор (общий объем — от 5-20 до 100 мл).

Перед введением следующую порцию физиологического раствора осторожно отсасывают введенной частью шприца в стерильный одноразовый контейнер с завинчивающейся крышкой или в стерильную одноразовую или стеклянную про­бирку с пробкой или оставляют в закрытом шприце, предварительно удалив из него воздух (как правило, 50-70% введенного физиологического раствора нахо­дится в лаваже).

Каждую отсасываемую порцию собирают в отдельную посуду.

По окончании процедуры соединяют пробы, полученные из одного и того же участка. Пробы из разных участков (например, правой верхней доли легкого и правой нижней доли) следует соединять вместе только после консультации с леча­щим врачом.

Транстрахеальная аспирация малоинформативна и чревата частыми осложне­ниями.

МОЧА

Исследуют среднюю порцию мочи, собранную утром у пациентов без катеризации мочевого пузыря. Перед сбором пробы необходимо тщательно промыть наружные половые органы и область заднего прохода теплой кипяченой водой; особое внимание при этом следует уделять обработке отверстия мочеиспуска­тельного канала у мужчин (преддверию влагалища — у женщин) для уверенности, что при проведении процедуры проба не будет дополнительно контаминирована микробами. Для обработки не допускается использование дезинфектантов, так как при попадании в пробу они могут ингибировать рост микроорганизмов.

Пробу передают в лабораторию не позднее чем через 2 ч с момента сбора. Для культурального исследования используют осадок центрифугата мочи. Не допуска­ется использование пробы из суточной мочи.

Для исследования не принимают мочу из мочеприемников, подкладного судна, пеленок У детей сбор мочи проводят методом надлобковой аспирации.

КРОВЬ

При подозрении на фунгемию с помощью венепункции периферических вен (чаще вены локтевого сгиба) или из пятки у новорожденных в асептических условиях берут 10 мл венозной крови (у детей — 5 мл) либо, при отсутствии положительного результата исследования и нарастании симптоматики, исследуют артериальную кровь.

При подозрении на эндокардит и вялотекущий сепсис с маленькой (10-30 КОЕ/ мл) концентрацией возбудителя в циркуляции:

• при остром процессе собирают две пробы из двух участков различных сосу­дов в течение первых 1-2 ч подъема температуры тела (не на пике темпера­туры!) и до начала терапии;
• при подострим или вялотекущем течении собирают в первый день три пробы с интервалом 15 мин и более. Если все пробы отрицательны, на вторые сутки после посева собирают еще три пробы;
• у пациентов с эндокардитами, получающими антибиотики, собирают по две отдельные пробы в каждый из трех дней с положительной клинической дина­микой терапии;
• у больных, в комплекс терапии которых включены антибиотики, собирают шесть проб в течение 48 ч; пробы необходимо собирать непосредственно перед введением (приемом) следующей дозы препарата;
• при наличии у больного лихорадки неясного генеза первоначально собира­ют две пробы из разных кровеносных сосудов (двух участков сосуда), затем через 24-36 ч еще две пробы на фоне повышения температуры тела (не на пике температуры!).

Все гемфлаконы с образцами венозной и/или артериальной крови, взятые у пациентов с подозрением на фунгемию или сепсис, сохраняют при температуре 37 °С в течение 7-10 сут для выявления медленно растущих видов.

Исследованию подлежат также постоянные центральные катетеры.

ПРОБЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОБСЕМЕНЕННОСТИ СОСУДИСТОГО КАТЕТЕРА

При подозрении на катетерассоциированную инфекцию материал собирают следующим образом:

• очищают кожу вокруг катетера стерильной марлевой салфеткой, смоченной 70% этиловым спиртом;
• с соблюдением правил асептики удаляют катетер;
• стерильными ножницами отрезают около 5 см от дистального конца катетера;
• помещают отрезанный кусок в сухую стерильную одноразовую пробирку с пробкой, или стеклянную пробирку, или стерильный одноразовый контейнер с завинчивающейся крышкой (для сбора мокроты);
• немедленно передают материал в лабораторию, для предохранения от высыхания можно добавить несколько капель стерильного физраствора.

СПИННОМОЗГОВАЯ ЖИДКОСТЬ

При люмбальной пункции собирают 3-5 мл ликвора. Сбор проб проводят мед­ленным заполнением трех пробирок тремя порциями материала для исследования в лабораториях. Используют только стерильные пробирки с плотно закрывающи­мися крышками (одноразовые с пробкой или стеклянные со стерильной резино­вой пробкой).

Из трех пробирок с материалом, полученным при люмбальной пункции, всегда отправляют пробирку с самым мутным содержимым, как правило, это вторая про­бирка в процессе сбора пробы. Материал центрифугируют, полученный суперна­тант исследуют серологическими методами, а осадок микроскопируют или иссле­дуют культуру.

ЖИДКОСТИ СТЕРИЛЬНЫХ ПОЛОСТЕЙ ОРГАНИЗМА

Плевральную, внутрибрюшинную жидкости, собранные путем аспирации или с помощью дренирования, собирают в стерильные пробирки с добавлением гепа­рина в разведении 1:1000. Дренажную жидкость при перитонеальном диализе собирают без добавки гепарина. Осадок центрифугата исследуют культуральными методами

Минимальный объем жидкости, который необходимо направить в лаборато­рию для выявления грибов (кроме крови, ликвора, мочи), составляет 10-12 мл. При этом следует иметь в виду, что больший объем пробы увеличивает возмож­ность обнаружения патогена.

КОСТНЫЙ МОЗГ

При подозрении на глубокий микоз (например, гистоплазмоз, криптококкоз)

3-5 мл аспирата костного мозга помещают в стерильную пробирку с 0,5 мл сте­рильного раствора гепарина 1:1000. Посев материала на питательную среду про­водят сразу после взятия материала.

ГНОЙ

Взятие гноя из абсцессов кожи и свищевых ходов проводят стерильными шпри­цем и иглой. Из вскрывшихся абсцессов и с поверхности язв взятие материала проводят бактериологической петлей, ложкой Фолькмана, пастеровской пипеткой. Если взятие материала осуществляют тампонами, что нежелательно, следует погружать тампон как можно глубже. При наличии в гное зерен и сгустков их обя­зательно берут на исследование.

Отделяемое дренажей, используемых для активной аспирации полостей, отса­сывают стерильным шприцем с плотным поршнем в объеме 2-4 мл. Затем на заполненный шприц надевают стерильную иглу, закрытую стерильным ватным тампоном, удаляют из шприца избыток воздуха. Ватный тампон сбрасывают в дезинфицирующий раствор. Конец иглы вкалывают в стерильную резиновую пробку и в таком виде шприц с материалом доставляют в лабораторию.

ЯЗВЫ И УЗЕЛКОВЫЕ УТОЛЩЕНИЯ

Мазок с поверхности язвенного дефекта существенно менее информативен, чем проба, выполненная методом кюретажа. Очищают поверхность язвы 70% этило­вым спиртом, затем дезинфицируют 1-2% раствором йода или другим дезинфек­тантом. Раствор йода удаляют после проведения процедуры стерильной салфет­кой, смоченной 70% этиловым спиртом, чтобы избежать ожога пациента.

• Сухой стерильной салфеткой удаляют некротические массы, детрит, гной.
• Кюретажной ложкой выскабливают основание язвы или узелкового утолще­ния.
• Помещают материал в стерильный контейнер.

При наличии экссудата в язве или узелке рекомендуют собирать пробу с помо­щью шприца во избежание контаминации материала.

БИОПТАТ

Материал для патоморфологического исследования берут из середины и краев очага поражения с соблюдением стандартных правил асептики. Пробы, получен­ные во время операции, помещают в емкость с анаэробной средой, в стерильную пробирку с тиогликолевой средой, закрытую стерильной резиновой пробкой, либо в стерильную сухую одноразовую пробирку типа «Эппендорф».

Материал помещают в специальный штатив из материалов, подлежащих стери­лизации в автоклаве, и немедленно отправляют в лабораторию.

В некоторых странах Евросоюза (Италии, Франции) при заборе биоптата при­нято использовать кроме флаконов со средами для аэробов и анаэробов также отдельный флакон с жидкой средой Сабуро для выявления микологических инфекций.

Транспортировка

Материал, предназначенный для культурального исследования микологических инфекций, можно хранить в транспортной среде или физрастворе при комнатной температуре не более 4 ч. предохраняя от воздействия прямых солнечных лучей и тепла.

Материал для гистологического исследования можно хранить до 48-72 ч в холодильнике при температуре 4-8 °С,

Допускается пересылка материала е замороженном состоянии без консервации. Недопустимо после размораживания повторное замораживание диагностического материала, что ведет к нарушению структуры и тинкториальных свойств грибных клеток. Исследуемый материал транспортируют в специальной таре или металли­ческих биксах.

Каждая проба материала должна быть промаркирована, иметь соответствую­щее направление, на котором указываются фамилия, инициалы, возраст или год рождения пациента, штрих-код или идентификационный номер истории болезни, идентификационный номер образца, локализация и тип образца, дата и время

взятия материала. На самом контейнере с образцом указывается идентификацион­ный номер образца или штрих-код. При отсутствии вышеназванной информации образец не подлежит исследованию и выбраковывается.