МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ
Н А К А З
03.08.1999 N 192
Про заходи щодо покращання
бактеріологічної діагностики дифтерії в Україні
Бактеріологічну діагностику дифтерії в Україні здійснює понад
1000 лабораторій закладів і установ охорони здоров'я.
Матеріально-технічний стан лабораторної бази в окремих областях
незадовільний. В Волинській, Закарпатській, Полтавській,
Рівненській, Чернігівській областях та АР Крим майже половина
лабораторій санепідстанцій і лікувально-профілактичних закладів, а
в цілому в країні 8,4% лабораторій СЕС і 27% лабораторій ЛПЗ не
мають необхідних умов для роботи зі збудниками III-IV груп
патогенності.
Лабораторії недостатньо забезпечені мікроскопами,
стерилізаторами, імунобіологічними препаратами, незважаючи на те,
що основні препарати для діагностики дифтерії виробляються в
Україні.
Бактеріологічні дослідження з метою діагностики і
профілактики дифтерійної інфекції в країні складають питому вагу в
загальному обсязі досліджень. В 1998 році їх виконано понад 3 млн.
Дані оперативної звітності, що надходять до МОЗ, свідчать про
незадовільну організацію в лікувально-профілактичних закладах
діагностичних бактеріологічних обстежень підлеглих контингентів
хворих, які повинні проводитися в день звернення за медичною
допомогою. В цілому в країні в 1998 році 14% хворих на дифтерію
обстежено з порушенням терміну (на 2 день і пізніше). Незадовільна
організація діагностичних бактеріологічних обстежень в
Полтавській, Луганській, Івано-Франківській, Херсонській,
Донецькій, Дніпропетровській, Чернігівській, Запорізькій, Одеській
областях та м. Києві.
В роки найвищого підйому захворюваності показник
бактеріологічного підтвердження клінічного діагнозу дифтерії
перевищував 80%. З 1995 року почалось поступове зниження цього
показника і в 1998 році зареєстровано найнижчий його рівень за всі
роки епідемії - 66%, в тому числі у дітей - 83%, у дорослих -
62%. Вкрай незадовільний показник бактеріологічного підтвердження
у м. Києві - 36%, Івано-Франківській області - 45%, АР Крим -
52%, Тернопільській, Волинській, Вінницькій областях - 57-61%.
Відмічається тенденція зростання питомої ваги захворювань з
клінічним діагнозом - дифтерія, при яких виділяються нетоксигенні
штами коринебактерій дифтерії. Якщо в 1994 р. питома вага таких
випадків складала 4,6%, то в 1998 р. - 15%. Поодинокі випадки
дифтерії з виділенням нетоксигенних штамів зареєстровані в 10
областях. В м. Києві такі випадки, навпаки переважають (47%).
Серед 62 випадків дифтерії з виділенням нетоксигенного штаму в
м. Києві в 53,2% був встановлений діагноз "реконвалесцент
дифтерії", при цьому в 94% цей діагноз було встановлено особам,
які звернулися за медичною допомогою в перші 4 дні від початку
захворювання, в тому числі 61% в перші 2 дні.
Зниження показника бактеріологічного підтвердження клінічного
діагнозу дифтерії в останні роки можливо пов'язане, з одного боку,
з погрішностями діагностики як клінічної, так і бактеріологічної,
з іншого - не можна виключити також зміни в популяції збудника (що
підтверджується результатами молекулярно-генетичних досліджень).
З метою покращання бактеріологічної діагностики дифтерії,
вирішення організаційних, методичних питань, підвищення
ефективності протиепідемічних і профілактичних заходів,
координації діяльності лабораторій закладів та установ охорони
здоров'я з зазначених питань Н А К А З У Ю:
Затвердити:
1. Інструкцію з бактеріологічної діагностики дифтерійної
інфекції (додається).
2. Положення про Центральну референс-лабораторію МОЗ України
з діагностики дифтерії (додається).
3. Покласти функції Центральної референс-лабораторії
Міністерства охорони здоров'я України з діагностики дифтерії на
бактеріологічну лабораторію Українського центру
держсанепіднагляду.
3.1. Доповнити Список національних центрів та
референс-лабораторій України, що забезпечують вивчення і
зберігання штамів різних мікроорганізмів (додаток 1 до наказу МОЗ
України від 14.12.92 N 183 ( v0183282-92 ) "Про режим роботи з
патогенними мікроорганізмами") пунктом 6.2. "Центральна
референс-лабораторія МОЗ України з діагностики дифтерії".
4. Міністру охорони здоров'я Автономної Республіки Крим,
начальникам управлінь охорони здоров'я обласних, Київської та
Севастопольської міських держадміністрацій, Головним державним
санітарним лікарям Автономної Республіки Крим, областей, міст
Києва та Севастополя, на водному, повітряному, залізничному
транспорті:
4.1. Створити в лабораторіях, що проводять бактеріологічні
дослідження на дифтерію (далі лабораторії) необхідні умови для
додержання протиепідемічного режиму.
4.2. Забезпечити лабораторії необхідним обладнанням
(стереоскопічні і біологічні мікроскопи, парові і сухоповітряні
стерилізатори), імунобіологічними препаратами гарантованої якості,
передбачити оснащення, в першу чергу, великих діагностичних
лабораторій сучасними, високочутливими приладами для
експрес-діагностики.
4.3. Забезпечити бактеріологічне обстеження хворих на
дифтерію або з підозрою на це захворювання, а також з гострою ЛОР
патологією протягом першої доби з моменту звернення за медичною
допомогою і своєчасну доставку матеріалу до лабораторій.
5. Головним державним санітарним лікарям Автономної
Республіки Крим, областей, міст Києва та Севастополя, на водному,
повітряному, залізничному транспорті:
5.1. Провести в III-IV кварталах 1999 року семінари з питань
сучасних методів лабораторної діагностики дифтерії для завідуючих
епідеміологічними відділами, бактеріологічними лабораторіями,
лікарів-бактеріологів, лаборантів та помічників епідеміологів. В
подальшому такі семінари проводити щорічно.
5.2. Забезпечити відповідно до Положення про порядок обліку,
зберігання, обороту, відпуску та пересилки культур бактерій,
вірусів, рикетсій, грибів, найпростіших, мікоплазм, бактерійних
токсинів, отрут біологічного походження, затвердженого МОЗ СРСР
18.05.79, збір, підтвердження та відправку штамів коринебактерій
до Українського центру держсанепіднагляду для підтвердження і
подальшого вивчення.
5.3. Посилити контроль за якістю бактеріологічної діагностики
дифтерії в лабораторіях закладів та установ охорони здоров'я. Не
рідше ніж 2 рази на рік перевіряти якість досліджень шляхом
контрольних завдань, за результатами контролю проводити заходи
щодо її покращання.
5.4. Інформацію про виконання цього наказу щороку до 1 лютого
надсилати до Українського центру держсанепіднагляду.
6. Директору Київського науково-дослідного інституту
епідеміології та інфекційних хвороб (Сельникова О.П.), головному
лікарю Українського центру держсанепіднагляду (Некрасова Л.С.)
продовжити роботу з вивчення збудників дифтерії на
молекулярно-генетичному рівні і створенню національної колекції
штамів.
Контроль за виконанням наказу покласти на начальників:
Головного санітарно-епідеміологічного управління (Бережнов С.П.),
Головного управління організації медичної допомоги дорослому
населенню (Піщиков В.А.), управління організації медичної допомоги
дітям і матерям (Гойда Н.Г.).
Міністр Р.В.Богатирьова
ЗАТВЕРДЖЕНО
Наказ МОЗ України
03.08.1999 N 192
ІНСТРУКЦІЯ
з бактеріологічної діагностики дифтерійної інфекції
Проведення протиепідемічних заходів, специфічного лікування
дифтерії вимагають здійснення своєчасної та якісної
бактеріологічної діагностики. Виявлення збудника при захворюваннях
з легким перебігом, які важко діагностувати клінічно, отримання
матеріалів, що характеризують інтенсивність циркуляції збудника
дифтерії серед населення в різних епідемічних умовах - необхідне
коло проблем, що вирішуються в системі епідемічного нагляду
бактеріологами.
Постановка діагнозу, який визначає необхідність введення
хворому протидифтерійної сироватки, здійснюється клініцистами,
бактеріологічне обстеження - додатковий метод, що дозволяє
клініцисту поставити діагноз дифтерії, але не відкидати його лише
на основі негативної бактеріології. У зв'язку з цим, бактеріологам
необхідно використовувати всі методи, що прискорюють
бактеріологічне дослідження і дають можливість видачі попередньої
відповіді на першому етапі бактеріологічного дослідження.
Поживні середовища, що визначають ріст коринебактерій вже
через 24 години, мікроскоп бінокулярний стереоскопічний (МБС) для
вивчення колоній, постановка проби на токсигенність на першу добу
росту колоній на чашках з первинним посівом - ось неповний перелік
умов, що сприяють видачі попереднього результату вже на 1-2 добу
дослідження і заключної відповіді про виділення збудника дифтерії
(токсигенних коринебактерій дифтерії) на 3 добу дослідження.
В наступні дні (4-5 добу) можуть бути додані відомості про
біохімічні властивості збудника дифтерії або видана відповідь про
виділення нетоксигенних коринебактерій дифтерії або інших
коринебактерій. При вивченні циркуляції збудника немає
необхідності видавати попередню відповідь і бактеріологічне
дослідження займає 3-5 діб. Негативна відповідь може бути видана
на 2-гу або 4-ту добу від початку дослідження.
1. Характеристика мікроорганізмів роду CORYNEBACTERIUM
За сучасною класифікацією бактерій, рід Corynebacterium
об'єднує декілька видів, які викликають захворювання у людей.
Міжнародними номенклатурами визначено вид Corynebacterium
diphtheriae, куди входять токсигенні (збудник дифтерії) та
нетоксигенні коринебактерії дифтерії (що не викликають захворювань
з клінічними проявами дифтерії). За даними зарубіжних дослідників
нетоксигенні C.diphtheriae асоціюються з септицемією,
ендокардитом, септичним артритом, остеомієлітом та церебральним
абсцесом.
C.ulcerans та C.pseudotuberculosis - природні патогени
великої та малої рогатої худоби, коней. Можливість зараження
людини C.ulcerans вкрай низька. Проте відомі випадки, коли при
клінічній картині захворювання, схожій з такою при дифтерії, були
виділені C.ulcerans токсигенні. Такі хворі частіше мешкали у
сільській місцевості і мали контакт із хворими тваринами.
Нетоксигенні C.ulcerans асоціюються з некротичними гранульомами і
захворюваннями легень. За літературними даними інфекція, викликана
C.pseudotuberculosis зустрічається серед населення дуже рідко, має
прояви у вигляді казеозного лімфаденіту, який придбано як
професійне захворювання. C.pseudotuberculosis часто є причиною
захворювань овець, рідше кіз та коней.
C.xerosis та C.pseudodiphtheriticum (псевдодифтерійна паличка
Гофмана) часто живуть в організмі людини. C.xerosis можуть бути
чинниками кон'юнктивітів, які довго і в'яло протікають. Багато
дифтероїдів - широко розповсюджені сапрофіти, тому орієнтовним
критерієм оцінки якості роботи бактеріологів може служити вміння
виділяти деякі дифтероїди зі слизових оболонок людини.
Мікроорганізми роду Corynebacterium - прямі або ледь зігнуті
палички, не утворюють спор, нерухливі і мають різний ступінь
плеоморфізму (різноманітність форм), грампозитивні, гетеротрофи,
факультативні анаероби, каталазопозитивні.
Для морфології C.diphtheriae характерно: велика
різноманітність у довжині клітин - від коротких кокоподібних до
тонких булавоподібних, плеоморфізм - клітини можуть мати форму
булави, сперматозоїда, ракетки, овоїда тощо, невпорядковане
розташування, яке часто нагадує римські цифри X, Y, наявність
гранул, може бути виражена внутрішньоклітинна смугастість, що є,
очевидно, скупченням зерен волютину. Описана спорідненість
волютину до метиленового синього і при обробці клітин цим
барвником гранули або смужки - скупчення гранул - забарвлюються в
синій колір, а протоплазма в деяких випадках може набути
рожевуватого відтінку. Не доцільно фарбувати за Грамом або іншими
складними методами для виявлення волютину, оскільки непроявлені
властивості можуть невірно трактуватися бактеріологами.
Для C.ulcerans і C.pseudodiphtheriticum характерна схильність
до паралелізму у розташуванні окремих клітин. 24-48-годинні
культури цих видів мають найчастіше кокоподібну чи овоїдну форму.
Звичайно колонії коринебактерій на твердих поживних
середовищах (наприклад, на кров'яному агарі) забарвлені в білий
або жовтуватий колір, непрозорі, мають круглу форму, діаметр
1-2 мм. Найчастіше вони бувають м'якої маслянистої консистенції,
деякі види роду коринебактерій можуть утворювати крихкі
шорсткуваті R-колонії. Багато видів цього роду утворюють яскраві
пігменти. Представники його не відзначаються високою
ферментативною активністю. Оптимум росту - 37 град. C стійкі до
низьких температур, чутливі до високих. Всі дезінфікуючі речовини
у звичайних концентраціях (3-5%) вбивають коринебактерії дифтерії
через 20-30 хвилин. Токсигенні C.diphtheriae більш чутливі до
антибіотиків, ніж нетоксигенні. Можливе формування
антибіотикорезистентних штамів. Результати тестування на
чутливість in vitro показали, що коринебактерії чутливі до
еритроміцину, пеніциліну, ампіциліну, цефуроксиму, хлорамфеніколу,
ципрофлоксацину, гентаміцину та тетрацикліну; деякі штами стійкі
до дії триметоприму та рифампіну. За даними зарубіжних авторів
нетоксигенні C.diphtheriae чутливі до бета-лактамів (крім
цефіксиму та цефподоксиму), цефлоксацину та ванкоміцину і тільки у
декількох штамів була виявлена стійкість до моноцикліну,
еритроміцину та рифампіну.
За структурою колоній і деякими біохімічними властивостями
C.diphtheriae розподіляються на так звані колоніальні або
культурально-біохімічні варіанти - gravis, mitis, belfanti та
internedius.
Через 48 години росту на кров'яно-телуритовому агарі:
- варіанти mitis та belfanti утворюють сірі або чорні,
круглі, гладкі, випуклі, з рівним краєм колонії, діаметром
1,5-2 мм, для них характерна варіабельність розміру колоній;
- варіант gravis звичайно утворює сірі або чорні матові сухі
колонії, які можна пересувати петлею по поверхні агару, не
порушуючи їх цілісності, крихкі, плоскі, гладкі, діаметром
1,5-2 мм;
- варіант intermedius утворює дрібні сірі прозорі колонії
плоскі, гладкі, діаметром 0,5-1 мм.
Колонії C.ulcerans схожі на колонії C.diphtheriae варіанту
gravis - чорні, матові, мають радіальну посіченість, у
C.pseudodiphtheriticum з'являється характерний світлий обвідок.
Але не можна спиратись лише на морфологічні властивості колоній
або мікробної клітини. Описані випадки бактеріологічної
гіподіагностики в 55% і 14,5% гіпердіагностики при ідентифікації
лише за морфологічними властивостями.
При ідентифікації C.diphtheriae необхідно використовувати
комплекс тестів, в першу чергу, визначення токсигенності -
основної ознаки збудника захворювання, яке проводиться на першу
добу росту підозрілих колоній на чашках первинного посіву
матеріалу. Обов'язковим є імунохімічний тест на токсигенність (in
vitro) - реакція дифузної преципітації в агарі, яка базується на
взаємодії дифтерійного екзотоксину і специфічних антитіл
дифтерійного антитоксину. За сучасними даними понад 20% штамів
нетоксигенних в реакції преципітації, мають ген токсигенності,
тобто потенційну змогу продукувати токсин, тому нетоксигенні
штами, що виділені від хворих та в осередках дифтерії, необхідно
вивчати за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР).
Представники роду Corynebacterium не відзначаються високою
ферментативною активністю, але визначення деяких біохімічних
властивостей полегшує їх ідентифікацію (див. табл.).
Ферментативну активність мікроорганізмів вивчають за трьома
тестами - визначення ферментів цистинази, уреази та
нітратредуктази. Середовища Гісса (кольоровий ряд)
використовуються в скороченому варіанті: глюкоза, сахароза,
крохмаль. Як додатковий, можна використовувати тест на
піразинамідазу.
Таким чином, ідентифікація C.diphtheriae базується на
визначенні токсигенних та деяких біохімічних властивостей, з
урахуванням морфології клітин (при необхідності) і колоній.
Основні біохімічні властивості коринебактерій
----------------------------------------------------------------------------------------
| Види коринебактерій | Токсигенні| Розщеплення | Віднов-|
| |властивості|------------------------------------| лення |
| | |цис-| піра- |глю-|саха-|крох-|сечо-|нітратів|
| | |тину|зинаміду|кози|рози |малю |вини | в |
| | | | | | | | |нітрити |
|----------------------------+-----------+----+--------+----+-----+-----+-----+--------|
| C.diphtheriae v.gravis | +- | + | - | + | - | + | - | + |
|----------------------------+-----------+----+--------+----+-----+-----+-----+--------|
| C.diphtheriae v.mitis | +- | + | - | + | - | - | - | + |
|----------------------------+-----------+----+--------+----+-----+-----+-----+--------|
| C.diphtheriae v.intermedius| +- | + | - | + | - | - | - | + |
|----------------------------+-----------+----+--------+----+-----+-----+-----+--------|
| C.diphtheriae v.belfanti | +- | + | - | + | - | - | - | - |
|----------------------------+-----------+----+--------+----+-----+-----+-----+--------|
| C.ulcerans | +- | + | - | + | - | + | + | - |
|----------------------------+-----------+----+--------+----+-----+-----+-----+--------|
| C.pseudotuberculosis | +- | + | - | + | +- | - | + | +- |
|----------------------------+-----------+----+--------+----+-----+-----+-----+--------|
| C.pseudodiphtheriticum | - | - | + | - | - | - | + | + |
|----------------------------+-----------+----+--------+----+-----+-----+-----+--------|
| C.xerosis | - | - | + | + | + | - | - | + |
----------------------------------------------------------------------------------------
2. Організаційно-методична робота
бактеріологічних лабораторій
Бактеріологічні лабораторії СЕС Автономної Республіки Крим,
обласних, Київської та Севастопольської міських, Центральних
басейнової та на залізничному транспорті виконують такі функції:
2.1. Надання консультативної та практичної допомоги
підвідомчим лабораторіям СЕС та ЛПЗ.
2.2. Підготовка спеціалістів з лабораторної діагностики
дифтерії.
2.3. Вивчення обсягів досліджень на дифтерію підлеглих
контингентів, оцінка їх достатності спільно з епідеміологами,
аналіз показників якості діагностики, інформування Українського
центру держсанепіднагляду МОЗ України двічі на рік до 20 січня та
до 20 липня.
2.4. Визначення потреби в поживних середовищах та
діагностичних препаратах, організація постачання підвідомчих
лабораторій.
2.5. Контроль якості бактеріологічної діагностики дифтерії та
впровадження заходів щодо покращання цієї роботи на території, що
обслуговується:
- перевірка на місці;
- аналіз показників роботи лабораторій;
- контроль за якістю ідентифікації культур коринебактерій;
- видача контрольних задач;
- проведення паралельних досліджень.
2.6. Контроль усіх серій нормальної кінської сироватки на
відсутність протидифтерійних антитоксичних антитіл, усіх серій
комерційних поживних середовищ та інгредієнтів, а також вибірковий
контроль якості поживних середовищ, що готуються у лабораторіях.
2.7. Відправка виділених штамів коринебактерій до
бактеріологічної лабораторії Українського центру
держсанепіднагляду МОЗ України для подальшого їх вивчення.
3. Обов'язки спеціалістів лабораторій,
що проводять дослідження на дифтерію
3.1. Навчити медичний персонал правилам взяття, посіву та
доставки матеріалу до лабораторії.
3.2. Систематично контролювати правильність взяття і доставки
матеріалу.
3.3. При прийомі матеріалу переконатися у тому, що він
відібраний із зіву та носа (2 пробірки), при призначенні
бактеріоскопії - окрема пробірка. Перевірити відповідність
маркування на пробірці із записом в направленні.
3.4. У реєстраційному журналі треба вказати дату, час і
правильність надходження матеріалу (порушення вказувати
конкретно). Матеріал приймається і досліджується незалежно від
встановленого порушення. Про порушення та необхідність повторного
взяття матеріалу інформується відповідальна особа закладу, звідки
надійшов матеріал. Якщо на протязі 3 годин матеріал повторно не
надійшов до лабораторії, ситуація розцінюється як надзвичайна, про
що сповіщається керівництву ЛПЗ (СЕС).
3.5. При виникненні в процесі дослідження підозри на
C.diphtheriae, негайно інформуються відповідні спеціалісти СЕС і
ЛПЗ. У реєстраційному журналі фіксується коли (дата, час) і кому
(прізвище, посада) подано повідомлення. Оперативна інформація по
телефону повинна супроводжуватися письмовою випискою на офіційному
бланку.
3.6. Кожне приготування поживних середовищ повинно
реєструватися у "Журналі приготування і контролю якості поживних
середовищ" і контролюватися.
3.7. Кожен лікар повинен систематично аналізувати якість
діагностики та вживати необхідні заходи щодо її поліпшення.
3.8. Порядок знищення отриманих патогенних культур
визначається закладом вищого рівня управління.
3.9. Усі сумнівні, атипові штами (мазки первинної
бактеріоскопії, якщо було призначено) терміново мають бути
направлені до закладу вищого рівня управління (базову лабораторію)
для подальшого вивчення або слід повідомити про необхідність
одержання консультації.
3.10. Персонал лабораторії повинен суворо дотримуватись
правил протиепідемічного режиму роботи.
4. Взяття і доставка матеріалу
для бактеріологічного дослідження на дифтерію
Для взяття матеріалу використовують сухі або попередньо
змочені 5% розчином гліцерину тампони.
В усіх випадках беруть слиз і плівки з ротоглотки та носа, в
тому числі при дифтерії незвичайних локалізацій (око, вухо, рана,
шкіра, піхва).
З ротоглотки матеріал беруть натще або не раніше, ніж через 2
години після прийому їжі, обертальними рухами з мигдаликів, дужок
піднебіння, язичка і задньої стінки глотки, за допомогою шпателя,
не торкаючись тампоном язика, слизової оболонки щік та зубів, при
наявності нальотів, матеріал беруть з границі вражених і здорових
тканин, злегка надавлюючи на них тампоном.
З носа матеріал беруть окремим тампоном, його вводять в один,
а потім в інший носовий хід, не торкаючись крил носа зовні.
(Попередньо ніс очищають від слизу сухим тампоном).
При прямій ларингоскопії матеріал (слиз, плівки) збирають
безпосередньо з гортані. При оперативному втручанні відбирають
слиз з інтубаційної трубки, а також плівки, подрібнені при
операції.
Для первинної бактеріоскопії матеріал беруть окремим тампоном
або до лабораторії направляють частину видаленої плівки, ретельно
розтертої між скельцями.
Вражені ділянки шкіри попередньо витирають "промокальними"
рухами стерильною марлевою серветкою або тампоном, змоченим
стерильним ізотонічним розчином хлориду натрію, обережно
піднімають або відгортають струпи і кірки й після цього сухим
тампоном відбирають матеріал.
При проведенні курсу лікування антибактеріальними препаратами
матеріал слід брати не раніше, ніж через 3 дні після закінчення
лікування, щоб виключити їх бактеріостатичну дію на збудника
дифтерії.
При постмортальних дослідженнях матеріал відбирають з
мигдаликів, гортані та порожнини носа.
Пробірки чітко маркують, скріпляють разом від кожної особи і
позначають номер у відповідності з направленням (ф. 204-у), що
додається, з обов'язковим зазначенням дати і часу відбору
матеріалу, прізвища лікаря і номера телефону, за яким можна
сповістити про попередній результат дослідження.
Тампони повинні бути доставлені до лабораторії не пізніше 3-х
годин після взяття матеріалу. Якщо схема забору і доставки
матеріалу передбачає посів на місці, то посіви доставляють в
лабораторію негайно або термостатують при 37 град. C і доставляють
в лабораторію не пізніше, ніж через 20-23 години, в
осінньо-зимовий період в сумках із грілками.
Примітка. На тампонах і середовищах повинна бути вказана дата
стерилізації (виготовлення).
5. Хід дослідження
Перший день
Посів матеріалу. При діагностичних дослідженнях матеріал
засівають на поверхню кров'яного агару (КА) та
кров'яно-телуритового агару (КТА), розлитих у чашки Петрі.
Необхідність використання кров'яного агару обумовлена тим, що на
ньому буде виявлено й іншу мікрофлору. Крім того, деякі штами
C.diphtheriae чутливі до телуриту калію, тому їх ріст може
пригнічуватись на телуритовому агарі.
Для посіву матеріалу від осіб, що обстежуються за
епідпоказаннями або з профілактичною метою, використовують тільки
кров'яно-телуритові середовища, оскільки такий матеріал може
вміщувати невелику кількість клітин C.diphtheriae, ріст яких на
неселективних середовищах буде пригнічуватись іншими
мікроорганізмами. Допускається використання транспортних
середовищ.
Посів від однієї особи роблять на одну чашку, використовуючи
при цьому одну половину поверхні середовища для посіву із
ротоглотки з мигдаликів, а другу - для посіву з носа. При посіві
матеріалу зі шкіри чи інших місць додають ще одну чашку. Чашки
попередньо зігрівають.
Не допускається посів матеріалу від кількох осіб на одну
чашку.
При посіві нативного матеріалу його втирають тампоном в
окрему ділянку КА площею 2 х 1 см, потім аналогічно на КТА, при
цьому тампон весь час повертають так, щоб перенести матеріал зі
всієї поверхні тампону. Потім тим же тампоном штрихами засівають
решту поверхні середовища (половину чашки). Такий метод дозволяє
засіяти весь матеріал з тампона, отримати ізольовані колонії
(чисту культуру) безпосередньо з чашки для подальшої
ідентифікації. Засіяні чашки або пробірки з транспортним
середовищем ставлять в термостат.
Другий день
1. Колонії, що виросли на чашках, проглядають через 24 години
після посіву матеріалу (якщо матеріал засівали у другій половині
дня, то перегляд здійснюють також у другій половині дня) за
допомогою МБС (окуляр 6, збільшення об'єктиву 2). Якщо ріст
колоній відсутній на КА та КТА середовищах, матеріал для
діагностичних досліджень треба відібрати повторно.
2. Чашки з підозрілими на коринебактерії дифтерії колоніями
відбирають для подальшої ідентифікації культури за всіма тестами.
Мікроскопію препаратів-мазків підозрілих колоній можна не
проводити. Підозрілі колонії на кров'яно-телуритових середовищах
через 24 години сірого кольору, випуклі, з рівними краями, в'язкі,
через 48 годин - сірі або чорні з металевим блиском, рівними або
ледь порізаними краями, в'язкі чи крихкі при дотику петлею.
3. З сумнівних колоній готують препарати-мазки.
Коринебактерії дифтерії, які виросли на середовищах з інгібіторами
росту (телурит калію), можуть бути вкорочені, потовщені, проте
зберігають властиві їм поліморфізм та характерне розміщення. Якщо
при мікроскопії виявляють палички, характерні для роду
коринебактерій, то ці колонії відбирають для подальшої
ідентифікації за всіма тестами. При роботі з колоніями слід
користуватись бактеріологічною петлею діаметром 1-2 мм.
Виявлення при мікроскопії чистих культур коків, дріжджів,
спорових паличок і т. п. дозволяє припинити дослідження на
дифтерію. Діагностичні дослідження продовжують згідно наказу МОЗ
від 22.04.85 р. N 535.
4. У випадку росту підозрілих однотипних колоній необхідно
відразу ж приступати до їх вивчення за рядом тестів ідентифікації
(токсигенні властивості, визначення цистинази) і виділити чисту
культуру на скошений сироватковий або кров'яний агар. Токсигенні
властивості вивчають не менше як у 2 ізольованих колоній шляхом
посіву однієї половини кожної колонії на середовище для визначення
токсигенності і непропаленою петлею на середовище Пізу, а другої
половини колонії - у пробірку із сироватковим агаром для
розмноження та збереження цієї культури. Враховуючи те, що в
досліджуваному матеріалі можуть знаходитися одночасно токсигенні
та нетоксигенні різновиди C.diphtheriae, необхідно при множинному
рості підозрілих колоній вивчати токсигенні властивості якомога
більшої кількості колоній (не менше як 20 колоній, змішуючи 5-6
колоній в одну бляшку).
5. Якщо виростає лише 1 колонія, її засівають на середовище
для визначення токсигенності і, не прожарюючи петлю, - у стовпчик
середовища для визначення цистинази. Для дальшої ідентифікації
матеріал можна брати з бляшки через 48 годин росту або через 24
години при виявленні токсигенних властивостей культури.
6. Чашки з первинним посівом досліджуваного матеріалу знову
ставлять в термостат на 24 години і проглядають їх повторно.
7. Висів з транспортного середовища здійснюють на тверді
поживні середовища, зігріті при кімнатній температурі або в
термостаті (15-20 хвилин), тампоном, віджатим об стінки пробірки,
або петлею, забираючи матеріал з осаду.
Третій день
1. Через 24 години при появі специфічних ліній преципітації
на середовищі для визначення токсигенності, позитивній пробі на
цистиназу досліджувану культуру ідентифікують як C.diphtheriae
токсигенну і видають документовану відповідь.
Якщо специфічні лінії преципітації відсутні на середовищі для
визначення токсигенності, чашки інкубують ще 24 години.
Якщо проба на цистиназу негативна, культуру ідентифікують як
інший вид коринебактерій, а не C.diphtheriae.
2. Культуру з сироваткового агару (після визначення її
чистоти), засівають на середовища для ідентифікації та визначення
біохімічного варіанту (сахароза, глюкоза, крохмаль, ферментів
уреази та нітратредуктази).
3. Чашки з первинним посівом досліджуваного матеріалу
проглядають повторно через 36-48 годин інкубації в термостаті за
допомогою МБС. При відсутності колоній, підозрілих на
C.diphtheriae, видають заключну відповідь, що C.diphtheriae не
виявлені. При наявності підозрілих колоній проводять ідентифікацію
культури (див. пп. 2-5 другого дня дослідження).
Четвертий день (або п'ятий)
1. При появі специфічних ліній преципітації на середовищі для
визначення токсигенності (через 24 години проби на токсигенність
48 годинного росту первинного посіву), позитивній пробі на
цистиназу видають документовану відповідь (див п. 1 третього дня
дослідження).
2. Культуру, що виросла на сироватковому агарі (виділену з
чашки у випадку 48-годинного росту), після визначення її чистоти
засівають на середовища для визначення біохімічних властивостей
(див. п. 2 третього дня).
3. Повторно (через 48 годин) враховують результати проби на
токсигенність, поставленої на 2-й день дослідження. Одночасно
проводять облік сахаролітичних властивостей та ферментативної
активності, поставлених на 3-й день дослідження.
При відсутності специфічних ліній преципітації через 48 годин
від постановки проби на токсигенність, але при позитивній пробі на
цистиназу, глюкозу, негативній пробі на уреазу і сахарозу культуру
ідентифікують як C.diphtheriae нетоксигенну, вказуючи біохімічний
варіант.
Якщо у цистиназопозитивних коринебактерій проба на уреазу
позитивна, слід також думати про забруднення дифтерійної культури
перш за все C.pseudodiphtheriticum. Для розмежування культур
необхідно зробити розсів на тверді поживні середовища, повторно
виділити культури коринебактерій і визначити їх біохімічні
особливості.
При виділенні токсигенних C.diphtheriae додатково видають
відповідь про біохімічні властивості (через 72 години або 96 годин
з моменту первинного посіву досліджуваного матеріалу).
Пам'ятати! Усі посіви інкубуються в термостаті при
37 +- 1 град. C.
Бактеріологічний висновок
1. Наявність специфічних ліній преципітації при визначенні
токсигенних властивостей, позитивна проба на цистиназу,
відсутність гідролізу сечовини, характерні культуральні та інші
біохімічні властивості дозволяють зробити висновок про те, що
виділена культура належить до виду C.diphtheriae, токсигенна,
варіанту gravis, mitis, belfanti або internedius.
2. Відсутність специфічних ліній преципітації при визначенні
токсигенних властивостей, позитивна проба на цистиназу,
відсутність гідролізу сечовини, характерні культуральні та інші
біохімічні властивості дозволяють зробити висновок, що виділена
культура належить до виду C.diphtheriae, нетоксигенна варіанту
gravis, mitis, belfanti або internedius.
3. При наявності ліній преципітації, ідентичних (таких, що
зливаються) до специфічних ліній преципітації контрольного штаму
C.diphtheriae, позитивних проб на уреазу, цистиназу, ферментації
глюкози і крохмалю, відсутності ферментації сахарози, редукції
нітратів в нітрити культуру відносять до виду C.ulcerans,
токсигенний варіант. При негативній крохмальній ознаці - культуру
ідентифікують як C.pseudotuberculosis.
При відсутності ліній преципітації при визначенні токсигенних
властивостей і наявності всіх інших ознак, характерних для
C.ulcerans або C.pseudotuberculosis, виділену культуру відносять
до виду C.ulcerans або C.pseudotuberculosis нетоксигенних, але
бактеріологічну відповідь вважають негативною. Ці штами слід
направляти в головну установу для подальшого вивчення.
4. При ідентифікації культури як C.pseudodiphtheriticus або
інших дифтероїдів бактеріологічну відповідь вважають негативною.
6. Методики ідентифікації коринебактерій
6.1. Визначення токсигенних властивостей
В основі методу визначення токсигенності коринебактерій (in
vitro) покладено взаємодію між токсином і антитоксином, яка
відбувається в твердих поживних середовищах в місцях оптимального
кількісного співвідношення токсину, продукованого коринебактеріями
дифтерії, що дифундує в агар, і антитоксичних антитіл, які
містяться в антитоксині. В тих ділянках агару, де токсин
зустрічається з антитоксином, випадає преципітат у вигляді білих
ліній, "стріл" чи "вусів" (Елек-тест).
Слід суворо стежити за щільністю середовища, pH, режимом
стерилізації, прозорістю, точним дотриманням цілого ряду технічних
умов постановки проби.
Токсигенність C.diphtheriae визначають, як правило, в чистій
культурі (відбираються окремі колонії і суміш колоній або культури
з сироваткового косяка). Культури, забруднені сторонньою
мікрофлорою, також можна випробовувати на токсигенність. При
відсутності у цих випадках преципітатів у агарі дослід повторюють
з виділеними чистими культурами.
Для постановки проби на токсигенність необхідно мати:
стерильні чашки Петрі з рівним дном; поживне середовище для
визначення токсигенності; паперові смужки; діагностичний
дифтерійний антитоксин, або диски з антитоксином; контрольний
токсигенний штам; нормальні сироватки тварин.
Засів проби. Якщо для визначення токсигенності
використовуються паперові диски з дифтерійним антитоксином, засів
культури проводять "бляшками" діаметром 0,7-0,8 мм навколо диску
(на відстані 0,5 см від диску), чергуючи "бляшки" досліджуваної
культури і контрольного штаму. На одну чашку можна ставити не
більше 4 дисків.
Якщо використовують паперові смужки, "бляшки" досліджуваної
культури висівають на відстані 0,7-0,8 см одна від одної і
0,5 см - від краю смужки.
При дослідженні на токсигенність половини колонії і суміші
5-6 колоній посів здійснюють "бляшками" з обох сторін смужки.
Половину колоній (окремої, ізольованої, або по половині від двох
колоній) розміщують на одній стороні чашки, а на другій - суміші
колоній. На одну чашку слід висівати не більше 10 "бляшок", з них
6 "бляшок" досліджуваної культури, 4 - контрольного штаму.
Контролем служить токсигенний штам 24 - 48-годинного росту. Чашки
з посівом ставлять в термостат.
Облік результатів. Результати враховують через 18-24 та 48
годин. Критерієм оцінки специфічності преципітатів є злиття ліній
преципітації досліджуваного штаму з лініями контрольного
(токсигенного) штаму. У випадках, коли у контрольного штаму
з'являється декілька ліній преципітації, специфічними слід вважати
найбільш чіткі преципітати, які з'являються першими.
Спостерігаються наступні варіанти в утворенні преципітатів:
1. Досліджувані C.diphtheriae, у яких утворюються
преципітати, вважаються токсигенними, якщо ці лінії преципітації
зливаються з відповідними специфічними лініями токсигенного штаму
або ідуть на сполучення з ними.
2. Досліджувані C.diphtheriae вважаються нетоксигенними:
а) якщо лінії преципітації у досліджуваної культури відсутні
при наявності специфічних ліній преципітації у контрольного штаму;
б) якщо лінії преципітації розміщені так, що їх кінці не
можуть злитися з кінцями специфічних ліній у контрольного штаму, а
ідуть навперехрест з ними (неідентичні);
в) лінії преципітації досліджуваного штаму зливаються з
неспецифічними лініями контрольного штаму;
г) лінії преципітації досліджуваного штаму перехрещуються із
специфічними лініями і зливаються з неспецифічними лініями
контрольного штаму.
Іноді з'являються множинні неспецифічні лінії преципітації.
Найчастіші причини гіподіагностики
при визначенні токсигенності коринебактерій
- Слабке утворення токсину штамом, що досліджується.
- Недостатня кількість інокуляту (потрібен масивний засів).
- Значна віддаленість "бляшки" від смужок (диску).
- Недостатня концентрація антитоксину на смужці (диску).
- Низька якість середовища: відхилення pH, висока
концентрація агару в середовищі (ускладнюється дифузія), надмірний
вміст заліза в агарі.
- Незадовільна якість нормальної кінської сироватки, що
додається до середовища (рекомендується сироватка великої рогатої
худоби), надмірне висушування поверхні агару;
недостатня прозорість агару.
- Незадовільна якість чашок Петрі (дефекти скла, подряпини,
наліт і т.д.).
Приготування чашок для постановки проби
на токсигенність
На середину поверхні застиглого середовища прожареним
пінцетом кладуть стерильні диски або паперову смужку, просочену
дифтерійним антитоксином. Чашки підсушують в термостаті протягом
15-20 хвилин, перевернувши догори дном і чашку, і кришку.
Приготування паперових смужок
Смужки фільтрувального паперу нарізають розміром
1,5 х 8,0 см, загортають по 2-4 штуки в пакетик, стерилізують в
автоклаві при 121 +- 1 град. C - 30 хвилин.
Змочують смужки в стерильній чашці Петрі. Для цього їх
переносять з пакетика стерильним пінцетом і змочують 0,25 куб. см
очищеного специфічною сорбцією дифтерійного антитоксину, який
містить 500 МО в 1 куб. см. Щоб не було надлишків антитоксину на
папірці, при перенесенні на агар обпаленим пінцетом, його злегка
струшують.
Визначення гену дифтерійного токсину
за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР)
ПЛР базується на вибірковій ампліфікації (збільшенні числа
копій) специфічної ділянки ДНК коринебактерії, яка містить
фрагмент А гену дифтерійного токсину, за допомогою ферменту -
термостабільної ДНК-полімерази. Цей фермент приймає участь у
синтезі протилежно орієнтованих взаємно комплементарних ланцюгів
ДНК, починаючи з олігонуклеотидних праймерів. Праймери - штучно
синтезовані короткі (5-20 нуклеотидів) одноланцюгові фрагменти
ДНК, що комплементарні 3'-5' кінцям нуклеотидної послідовності
tox-гену, яка ампліфікується. Праймери обмежують фрагмент ДНК,
котрий буде мільйони разів скопійований в ході реакції.
Дослідження методом ПЛР включає три етапи:
1. Підготовка досліджуваного матеріалу:
- виділення ДНК (досліджуваний матеріал або культуру вносять
в 1 куб. см дистильованої води, кип'ятять протягом 20 хвилин при
100 град. C, центрифугують; надосадова рідина містить ДНК);
- приготування реакційної суміші, до якої входять: буфер з
іонами Mg, суміш чотирьох дезоксинуклеотидтрифосфатів,
Taq-полімераза, суміш двох праймерів, внутрішній контроль,
дистильована вода та виділена ДНК.
2. Власне полімеразна ланцюгова реакція. Для її виконання
необхідний термостат з програмним забезпеченням (так званий
термоциклер або ампліфікатор). Реакція складається із декількох
циклів, що повторюються, в кожному з яких можна виділити три
стадії:
- денатурація ДНК (реакційна суміш нагрівається до
температури 95 град. C, розриваються водневі зв'язки і
полінуклеотидні ланцюги, що складають структуру ДНК,
роз'єднуються);
- зв'язування праймерів (праймери специфічно гібридизуються з
відповідними послідовностями нуклеотидів tox-гену, обмежуючи
специфічну ділянку ДНК, що відповідає за токсигенні властивості
коринебактерії);
- ензиматична добудова ДНК (використовуючи праймери та вільні
дезоксинуклеотидтрифосфати, термостабільна ДНК-полімераза
добудовує ланцюг ДНК). Процес синтезу відбувається при
70-72 град. C протягом 20-40 сек.
Створені в першому циклі ампліфікації нові ланцюги ДНК
служать матрицями для синтезу аналогічних фрагментів (ампліконів).
Таким чином, амплікони у розчині накопичуються і їх кількість
n
становить 2 , де n - кількість циклів ампліфікації. Отже, якщо у
розчині знаходилась тільки одна молекула ДНК, то за 30-40 циклів у
8
розчині накопичується біля 10 молекул амплікона. Цієї кількості
достатньо для достовірної візуальної детекції цього фрагмента
методом електрофорезу в агарозному гелі.
3. Детекція продуктів ампліфікації в електрофоретичному
аналізі. Для цього етапу необхідні джерело постійного струму,
камера для електрофорезу, ультрафіолетовий трансілюмінатор,
хімічні реактиви та спеціальні фарбники.
Новостворені ДНК-фрагменти, в більшості мають однакову
молекулярну масу, тому в електрофоретичному полі вони будуть
пересуватися в агарозному гелі з однаковою швидкістю і
спостерігатимуться в ультрафіолетовому промінні у вигляді однієї
смужки.
Агарозний гель готують із агарози та буфера, який
використовується в електрофоретичній камері, охолоджують до
50-60 град. C, заливають в приготовані для цього форми і за
допомогою спеціальних гребінців роблять в гелі "кишені" для
нанесення зразка. Після застигання геля в "кишені" вносять
підфарбований ампліфікат і проводять електрофоретичний розподіл
продуктів ампліфікації протягом 45-60 хвилин. Гель обробляють
бромистим етідієм і розглядають в УФ промінні.
Результати оцінюють у порівнянні з позитивним контролем. Якщо
зразок, що досліджується, вміщує tox-ген, при фарбуванні бромистим
етідієм він утворює специфічну електрофоретичну смужку, яка
знаходиться на рівні смужки позитивного контролю. Негативні зразки
не повинні утворювати будь-яких смужок. Для документування
результатів ПЛР гель фотографують в ультрафіолетовому світлі на
фотоплівку "Мікрат-300", яку проявляють звичайним способом, або
застосовують апарати типу "Pollaroid".
ПЛР має деякі переваги перед традиційним методом визначення
токсигенності C.diphtheriae:
- можливість повної автоматизації;
- швидкість отримання результатів (на протязі 4-6 годин);
- висока чутливість (дозволяє визначити навіть одного
збудника в матеріалі, що досліджується);
- 100% специфічність методу (наявність у зразку, що
досліджується, сторонньої мікрофлори не впливає на результат
реакції, тобто ПЛР не потребує дослідження "чистої культури");
- можливість дослідження практично будь-якого матеріалу.
В той же час ПЛР потребує спеціальної техніки і реагентів,
які дорого коштують, відповідних приміщень, а тому може бути
виконана тільки в спеціалізованих лабораторіях. В Україні така
лабораторія функціонує на базі Українського центру
держсанепіднагляду.
Всі нетоксигенні C.diphtheriae, що виділені від хворих та
контактних у вогнищах дифтерії необхідно надсилати до Українського
центру держсанепіднагляду для подальшого вивчення в ПЛР.
6.2. Визначення біохімічних ознак.
Визначення ферменту цистинази (проба Пізу)
C.diphtheriae, C.ulcerans, C.pseudotuberculosis мають
фермент - цистиназу, у C.pseudodiphtheriticum та інших дифтероїдів
він відсутній.
В середовище, розлите у вузькі пробірки стовпчиком, засівають
культуру уколом. При рості цистиназопозитивні коринебактерії,
завдяки цистиназі, розщеплюють цистин, що міститься у середовищі,
а сірководень, який при цьому утворюється, вступає у реакцію з
оцтовокислим свинцем, що входить до складу середовища, останній
переходить в сірчанокислий свинець - сполуку темно-коричневого
кольору. Гіпосульфіт натрію, що входить до складу модифікованого
середовища, прискорює утворення сірчанокислого свинцю та
ідентифікацію цистинази. C.diphtheriae викликають не лише
почорніння середовища по ходу укола, але й утворюють навколо нього
"хмарку" темно-коричневого кольору на відстані 1 см від поверхні.
Результати враховуються через 24 години. Для отримання
попередньої відповіді (через 3 години) необхідно внести в
середовище багато культури (5-6 колоній). Рекомендується одночасно
ставити контроль середовища.
Визначення фермента піразинамідази
Тест дозволяє диференціювати патогенні коринебактерії
(негативний результат) від інших коринебактерій (позитивний
результат). Фермент піразинамідаза каталізує гідроліз піразинаміда
до піразинової кислоти та амонію.
Для постановки тесту в стерильну пробірку вносять
0,25 куб. см стерильної дистильованої води. Готують в ній густу
(як "молоко") суспензію досліджуваної культури. Таким же чином
готують суспензії позитивного та негативного контрольних штамів.
Стерильним пінцетом вносять в кожну пробірку по одній
діагностичній таблетці Rosco N 598-21. Інкубують при 37 град. C
протягом 4 годин.
Для обліку результатів у кожну пробірку додають по 1 краплі
5% водного розчину сульфату амонійного заліза (щойно приготованого
або такого, що зберігався при - 20 град. C).
Патогенні коринебактерії (C.C.diphtheriae,
pseudotuberculosis, ulcerans) не змінюють кольору суспензії у
пробірці (негативний результат), вона залишиться безбарвною або
жовтуватого кольору. Інші коринебактерії змінюють колір суспензії
(позитивний результат) на червоний або оранжевий.
Визначення фермента уреази
Псевдодифтерійні бактерії, C.ulcerans, C.pseudotuberculosis і
деякі інші мікроорганізми роду Corynebacterium мають фермент
уреазу, здатний розщеплювати сечовину з утворенням аміаку і
вуглекислоти. C.diphtheriae цим ферментом не володіють.
Пробу на уреазу можна ставити в двох варіантах: шляхом посіву
на бульйон з сечовиною та за методом Заксе:
а) в бульйон з сечовиною засівають чисту культуру
коринебактерій і ставлять в термостат. Облік результатів проводять
через 18-24 години;
б) метод Заксе. Змішують (ex tempore) реактив A (1 частину) і
реактив B (19 частин). Суміш розливають у вузькі пробірки по
0,1 куб. см і вносять кілька петель досліджуваної культури. Не
можна брати конденсаційну воду, оскільки вона має лужну реакцію і
може змінити pH середовища, а отже і колір індикатора. Пробірки
ставлять в термостат на 30 хвилин.
Уреаза розщеплює сечовину, змінює pH середовища, що
призводить до його почервоніння. Якщо фермент уреаза відсутній,
зміна забарвлення середовища не відбувається. Рекомендується
одночасно ставити контроль середовища.
Визначення сахаролітичних ферментів
Сахаролітичну активність коринебактерій дифтерії визначають
на середовищах з вуглеводами: сахарозою, глюкозою і розчинним
крохмалем.
Повну петлю культури вносять в кожну пробірку з середовищем.
Облік результатів проводять через 24 години, а при негативній
крохмальній ознаці - враховують тест через 48 годин перебування
посівів в термостаті.
При зброджуванні вуглеводів, тобто при кислотоутворенні,
спостерігається відновлення знебарвленого фуксину і середовище
набуває малинового кольору.
Відновлення нітратів в нітрити
Здатність коринебактерій дифтерії відновлювати солі азотної
кислоти (нітрати) в солі азотистої кислоти (нітрити) є додатковою
ознакою, що дозволяє ідентифікувати C.belfanti і C.ulcerans, у
яких ця ознака негативна. Пробірки з середовищем засівають
культурою, що вивчається, і інкубують в термостаті 24 години. Для
контролю інкубують пробірку з середовищем, не засіяним культурою.
Якщо нітрат відновлено в нітрит, то, при додаванні 3 крапель
реактиву Грісса або Касаткіна до засіяного середовища, з'являється
червоне забарвлення. Середовище в контрольній пробірці кольору не
змінює.
Використання паперової індикаторної системи
для ідентифікації та визначення біоварів C.diphtheriae
Для ідентифікації та визначення біоварів C.diphtheriae можуть
використовуватись паперові індикаторні диски з глюкозою,
сахарозою, сечовиною та крохмалем, з набору "Б" для ідентифікації
ентеробактерій, що випускається фірмою "ІмБіо", м. Нижній
Новгород. Виготовлення дисків з крохмалем та для визначення
нітрат-редуктази наведено в розділі "Поживні середовища".
Готується густа суміш мікробів в об'ємі 1,2-1,5 куб. см
стерильного 0,85% розчину хлориду натрію з pH 7,3 +- 0,1 і по
0,3 куб. см переноситься в 4 пробірки. В кожну пробірку занурюють
диск з відповідним вуглеводом. Пробірки поміщають у термостат.
Облік результатів проводять через 40 хвилин - 2 години для
визначення уреазної активності і 5-24 години - для визначення
сахаролітичних властивостей.
При наявності уреази білий диск з сечовиною забарвиться в
рожево-малиновий колір, при відсутності - залишиться білим.
Диски з глюкозою та сахарозою при наявності відповідних
ферментів змінять червоний колір на жовтий вже через 5-6 годин.
Для визначення крохмальної ознаки через 18-24 години
інкубації в пробірку з відповідним субстратним диском додають
індикаторний диск з йодом. Через 1-2 хвилини після цього, при
негативній реакції з'являється темно синє забарвлення, при
позитивній - колір розчину залишається без змін.
7. Імунобіологічні препарати та допоміжні матеріали
Якість поживних середовищ є важливою умовою при
бактеріологічному дослідженні. Щоб отримати максимальну прорість
та висіваність коринебактерій з матеріалу, що досліджується,
необхідно створити оптимальні умови для росту та розмноження цих
бактерій, збереження їх біологічних властивостей та умов для
інгібіції супутньої мікрофлори. Це досягається шляхом використання
універсальних поживних середовищ з доданням крові та телуриту
калію. Телурит калію не перешкоджає росту коринебактерій і
практично повністю інгібує ріст побічної мікрофлори.
Коринебактерії здатні відновлювати телурит калію до металічного
телуру (речовина чорного кольору) та накопичувати його всередині
клітин. Тому на кров'яно-телуритових середовищах, які є також
диференційно-діагностичними, колонії коринебактерій набувають
сірого або чорного кольору.
В даний час, як основу для поживних середовищ, використовують
поживні агари (СПА, еритрит-агар, АГВ).
Якщо ростові властивості поживного середовища не
задовольняють вимог, агарові основи готують на бульйонах (СПБ,
комерційний або виготовлений в лабораторних умовах, перевар
Хоттінгера, 1% пептонна вода з вмістом амінного азоту
150-180 мг %).
Крім зазначених, для первинного посіву можна застосовувати
комерційне середовище "Коринебакагар", яке не потребує додавання
крові.
Для визначення токсигенних властивостей коринебактерій
дифтерії випускається комерційне сухе середовище (ВТДМ), для
визначення ферменту цистинази - комерційне сухе середовище для
визначення ферменту цистинази, що є аналогом середовища Пізу.
Кращою основою для приготування середовищ для визначення
токсигенності та цистинази залишається мартенівський пептон, який
готують в умовах лабораторії або у відділах поживних середовищ
деяких НДІ.
При приготуванні поживних середовищ для визначення
токсигенності використовують нормальні сироватки коня або великої
рогатої худоби (ВРХ). Сироватки непридатні, якщо вони каламутні,
гемолізовані (червоного, бурого кольору) або на них є позначення
"для технічних цілей". Необхідно здійснювати попередній контроль
усіх серій сироватки, що надходять до лабораторії, з токсигенним
контрольним штамом на перевіреному середовищі на токсигенність і
контроль на відсутність протидифтерійних антитоксичних антитіл в
кінських сироватках в РПГА з дифтерійним антигенним діагностикумом
(див. інструкцію до препарату).
Для відсіву колоній та культивування коринебактерій готують
сироватковий агар на будь-якій поживній основі, що застосовується
для культивування коринебактерій дифтерії.
Застосування звернутої сироватки недоцільне.
Для визначення сахаролітичних властивостей використовуються
середовища на 1% пептонній воді.
Дозволяється використовувати тільки ті імунобіологічні
препарати, що зареєстровані і дозволені до використання в Україні.
Перелік імунобіологічних препаратів, що зареєстровані і
дозволені до використання в Україні надано в додатку 3.
Терміни та умови зберігання діагностичних препаратів,
поживних середовищ, їх компонентів, фарб та індикаторів наведені в
додатку 1.
Усі хімічні реактиви, що використовуються при приготуванні
поживних середовищ, повинні бути кваліфікації ЧДА, якщо в
рецептурі нема інших вказівок.
Виготовлення поживних середовищ
Загальні вимоги до виготовлення поживних середовищ викладені
в ГОСТ 10.444.1-84.
7.1. Транспортні середовища
Транспортне напіврідке середовище
(модифікація Ю.М.Фельдмана)
З сухих комерційних агарових препаратів готують середовище з
розрахунку 1 г поживного агару на 100 куб. см перевару Хоттінгера
або поживного бульйону. Вміст амінного азоту - 150-180 мг %,
pH - 7,6.
Стерилізують в автоклаві при 121 +- 1 град. C протягом 20
хвилин або при 112 +- 1 град. C - 30 хвилин, асептично додають
10 куб. см сироватки та 1 куб. см 2% телуриту калію. Розливають в
пробірки по 5 куб. см. Середовище вибірково контролюють на
стерильність в термостаті протягом 48 годин.
Транспортне середовище ЕМЄС (AMIES)
(модифіковане Стюартом)
Дистильована або очищена вода 1 куб. дм
Агар 4 г
Розчинити, нагріваючи до кипіння, охолодити і внести такі
інгредієнти:
NaCl 3,0 г
KCl 0,2 г
Na PO безводний 1,15 г
2 4
KH PO 0,2 г
2 4
Тіогліколат натрію 1,0 г
CaCl (1 % щойно приготований розчин) 10 куб. см
2
MgCl |6P O (1 % розчин) 10 куб. см
2 2
Перемішати до повного розчинення і додати 10 г деревного
вугілля. Ретельно перемішати, розлити у пробірки об'ємом
7 куб. см, наповнюючи їх майже до вінець, і закрити пробками, що
закручуються. При відсутності таких пробірок, використовують
звичайні, зберігаючи той же принцип. Автоклавувати при
121 +- 1 град. C протягом 15 хвилин. Переконатися, що пробірки
закриті щільно, і охолоджувати в перевернутому вигляді, щоб
вугілля в середовищі розподілилось рівномірно. Кінцева pH
середовища - 7,2.
Зберігати в темному прохолодному місці.
7.2. Середовища для первинного посіву
досліджуваного матеріалу
Кров'яний агар
До 100 куб. см 2% розплавленого і охолодженого до 50 град. C
поживного агару (pH - 7,6) стерильно додають 10 куб. см крові,
ретельно перемішують і розливають у чашки Петрі.
Кров'яно-телуритовий агар (КТА)
До 100 куб. см 2% поживного агару pH - 7,6 (3,5 або 5 г
сухого поживного агару, виходячи з пропису на етикетці, на
100 куб. см різних бульйонів або дистильованої води),
розплавленого і охолодженого до 50 град. C, додають 2 куб. см 2%
розчину телуриту калію і 10-15 куб. см гемолізованої крові (або
кров'яної суміші).
Поживні агарові основи розливають в стерильні флакони і
стерилізують при 112 +- 1 град. C протягом 30 хвилин з попереднім
прогрівом текучою парою при 100 град. C протягом 3 хвилин.
Пам'ятати! Поживні середовища для первинного посіву
розливають у чашки Петрі шаром 3-4 мм.
Середовище Клауберга II
До 100 мл 3% поживного агару pH = 7,6, розплавленого і
охолодженого до 50 град. C, додають 3 мл 2% розчину телуриту
калію, 10 мл гліцеринової суміші та 50 мл "лакової" крові.
Приготування гліцеринової суміші. До 40 мл дефібринованої
крові (або розбитих у фізіологічному розчині згустків,
еритроцитарної маси) додати 20 мл стерильного (при температурі
110 град. C протягом 30 хвилин) гліцерину. Якщо кров, згустки,
еритроцитарна маса, які використовуються, були не стерильні, то
кров'яну гліцеринову суміш необхідно витримати в холодильнику при
температурі 6 +- 2 град. C протягом 3 тижнів. Зберігають в умовах
холодильника протягом 4-х місяців.
Приготування "лакової" крові. До 34 мл стерильної
дистильованої води додати 16 мл дефібринованої крові (або розбитих
у фізіологічному розчині згустків).
Приготування розчину телуриту калію (K TeO )
2 3
Для приготування телуритових середовищ використовують
комерційний препарат 2% розчин телуриту калію або його готують
таким чином: у 100 куб. см дистильованої води розчиняють 2 г
телуриту калію. Розчин стерилізують нагріванням на киплячій
водяній бані протягом 30 хвилин і зберігають при кімнатній
температурі. При випаданні осаду розчин знову нагрівають на
водяній бані до повного його розчинення. При поганій розчинності
реактиву готують 1% розчин, але відповідно додають його до
середовищ у подвійному об'ємі. Сухий телурит калію зберігають в
посудині з темного скла з притертою пробкою, зважаючи на його
гігроскопічність та токсичність. Розчин перевіряють, виготовивши
середовища, титрованою кількістю коринебактерій дифтерії і
стафілокока у відповідності з описаною методикою.
Приготування крові, кров'яних
і кров'яно-телурових сумішей
Використовують найрізноманітніші джерела одержання крові і
кров'яних сумішей. Найкращою є дефібринована кров великої рогатої
худоби, коней, свиней, овець, кролів. Кров забирають в стерильні
бутлі з намистинами, монтуючи спеціальні системи з дотриманням
усіх правил асептики. В окремих випадках кров збирають, зливаючи
перші порції крові поза бутлем.
Можна використовувати кров людини (цитратну і з
консервантами), готуючи з неї спеціальні кров'яні суміші.
Необхідною умовою є зливання рідкої відстояної частини крові з
цитратом чи іншими консервантами. В залишену еритроцитарну масу
додають стільки ж, скільки злили рідкої частини крові, стерильної
дистильованої води або фізіологічного розчину чи сироватки і
телуриту калію.
Хорошою сировиною для отримання кров'яної суміші є
еритроцитарна маса - відходи гамаглобулінового виробництва. Її
заливають стерильною дистильованою водою або гліцерином з
розрахунку 1/4-1/5 об'єму еритроцитарної маси і додають телурит
калію.
Можна використовувати кров'яні згустки після відсмоктування
сироватки для виробництва гамаглобуліну, згустки плацентарної
крові, одержані безпосередньо від породіль, згустки абортної
крові. Згустки збирають в стерильні бутлі зі скляними намистинами
або битим склом і розбивають їх. Якщо не вдається розбити, згустки
заморожують і розморожують (2-3 рази на добу ставлять в морозильну
камеру), після чого вони легко руйнуються. Потім додають
стерильний фізіологічний розчин або дистильовану воду 1/4-1/5
об'єму згустків і телурит калію.
Для кращого збереження крові чи кров'яної суміші до кожної
порції об'ємом 10-15 куб. см, додають до 100 куб. см агару,
доливають 1 куб. см 2% розчину телуриту калію. Таку суміш можна
зберігати в холодильнику до 2-х місяців.
Для приготування кров'яного телуритового середовища на кожні
100 куб. см поживного агару додають від 11 до 16 куб. см кров'яної
телуритової суміші і 0,1 куб. см 2% розчину телуриту калію.
Приклад розрахунку: до 200 куб. см еритроцитарної маси, що
лишилась після того, як злили 30 куб. см рідкої відстояної частини
крові з консервантом, додали 30 куб. см сироватки або
дистильованої води чи фізрозчину. Таким чином, отримали
230 куб. см кров'яної суміші, що складає приблизно 21 порцію, якщо
додавати по 11 куб. см цієї кров'яної суміші до кожних 100 куб. см
агару. Для консервації 230 куб. см кров'яної суміші необхідно
додати 1/2 порції телуриту калію, тобто 21 куб. см. Надалі
готувати кров'яні телуритові середовища потрібно наступним чином -
до 100 куб. см агару додати 12 куб. см кров'яної телуритової
суміші і 1 куб. см 2% розчину телуриту калію.
Сироватковий агар
До 100 куб. см розплавленого і охолодженого до 50 град. C
поживного агару (pH 7,6) стерильно додають 10 куб. см сироватки.
Перемішують, розливають в стерильні пробірки по 3-4 куб. см і
скошують. Кожна партія сироваткового агару перевіряється на
стерильність: декілька пробірок цієї партії ставлять на добу в
термостат. У випадку проростання середовища знищується вся партія.
7.3. Середовища для визначення токсигенності
Пам'ятати! Поживний агар для визначення токсигенності,
розлитий у флакони, вимагає багаторазового розплавлення, а тривала
термічна дія значно погіршує його якість. При невеликому об'ємі
роботи середовище доцільно розливати в пробірки по 17 куб. см
(кількість, необхідна для приготування однієї чашки). При великому
об'ємі роботи для одноразового використання розливають в стерильні
флакони (70-80 куб. см).
Сухий поживний агар
для визначення токсигенних властивостей
дифтерійних мікробів (ВТДМ)
3 г сухого порошку ВТДМ розчиняють у 100 куб. см води,
ретельно розмішують на слабому вогні, нагрівають до повного
розплавлення агару при постійному помішуванні, кип'ятять протягом
5-7 хвилин під закритою ватно-марлевою пробкою, фільтрують через
ватно-марлевий або тканинний фільтр. Розливають в стерильній
посуд. Стерилізують одноразово текучою парою протягом 30 хвилин.
Перед розливанням у чашки Петрі до розплавленого і охолодженого до
50 град. C середовища додають 20% сироватки.
Агар для визначення токсигенних властивостей
C.diphtheriae з середовищем 199
Вода дистильована 300 куб. см, середовище 199 - 700 куб. см,
агар ВТДМ - 30 г.
Агар ВТДМ розмішати у суміші дистильованої води і середовища
199, кип'ятити до повного розчинення 3-5 хвилин, профільтрувати
через ватно-марлевий фільтр, прогріти 30 хвилин на водяній бані.
Розлити по 20-22 куб. см в чашки або пробірки.
Середовище для визначення токсигенних властивостей
C.diphtheriae на агарі АГВ
Вода дистильована - 90 куб. см, АГВ - 2,7 г, цистин (в 5%
розчині NaHCO ) - 2 куб. см
3
Наважку АГВ внести до дистильованої води, кип'ятити до
повного розчинення. Розчинити 0,5 г NaHCO в 10 куб. см
3
дистильованої води, внести 0,1 г цистину і кип'ятити до повного
розчинення цистину. 2 куб. см киплячого лужного розчину цистину
внести до розплавленого АГВ. Довести pH до 7,7. Розлити по 17 куб.
см в пробірки. Стерилізувати 10 хвилин при 112 +- 1 град. C.
Додати асептично 3 куб. см сироватки. Розлити у чашки по
20 куб. см.
Середовище для визначення токсигенних властивостей
C.diphtheriae на основі середовища Пізу
Сухий поживний агар 2% (наважка за прописом на етикетці),
м'ясо-пептонний бульйон - 100 куб. см, цистин (розчин в 1N HCl) -
1 куб. см.
Встановити pH 7,7-7,8 10 % розчином NaOH. Розлити по
17 куб. см в пробірки. Стерилізувати 10 хвилин при 112 +- 1
град. C. Охолодити до 50 град. C. Додати стерильно 3 куб. см
сироватки. Розлити у чашки по 20 куб. см.
Виготовлення цистину. 1 г цистину розчинити в 20 куб. см
1N HCl (порошок додавати поступово розчиняючи). 1N HCl готують з
фіксаналу або 10 куб. см HCl + 90 куб. см води.
Середовище для визначення токсигенних властивостей
C.diphtheriae на мартенівському агарі
Мартенівський пептон - 0,5 куб. дм, м'ясна вода -
0,5 куб. дм, агар-агар 15-18 г (1,5%-1,8%), (1,5% агар
використовують при додаванні 20% кінської сироватки, 1,8% - при
додаванні 30% сироватки ВРХ), оцтовокислий натрій - 5 г,
мальтоза - 3 г.
Агар-агар промивають протягом робочого дня у проточній
водопровідній воді, ретельно відтискають і переносять в 1 куб. дм
мартенівського бульйону (0,5 куб. дм мартенівського пептону і 0,5
куб. дм м'ясної води). Встановлюють pH 7,8-8,0 по папірцю з
індикатором крезоловий червоний, який при цій реакції змінює
жовтий колір на рожево-малиновий, шляхом додавання лугу (20%
розчину NaOH) до бульйону. Бульйон кип'ятять протягом 10 хвилин, з
моменту закипання, потім додають 0,5% (5 г на 1 куб. дм)
оцтовокислого натрію, 0,3% мальтози (3 г на 1 куб. дм),
перевіряють pH і, якщо потрібно, знову доводять до 7,8-8,0,
кип'ятять протягом 15 хвилин, дають відстоятися в термостаті 2-3
години і фільтрують через тканинний або ватно-марлевий фільтр.
Розливають в стерильний посуд і стерилізують одноразово текучою
парою протягом 30 хвилин.
Поживну основу розплавляють на водяній бані при 90 град.,
охолоджують до 50 град. C і додають 20% кінської сироватки (1,5%
агар) або 30% сироватки ВРХ (1,8% агар). Так, до агару, розлитого
в пробірки, додають 2 куб. см кінської сироватки або 3 куб. см
сироватки ВРХ, обпалюють краї пробірки і виливають (асептично) в
стерильну чашку Петрі, рівномірно розподіляючи по дну чашки
обережним похитуванням, не спінюючи середовища.
Мартенівський пептон
Свинячі шлунки, бажано свіжі, з пружними стінками, великою
кількістю слизу і без катаральних явищ очищають від жиру (шлунки,
просочені жовччю, відкидають), не промиваючи, подрібнюють у
м'ясорубці. Фарш складають в бутлі місткістю 3-5 куб. дм і
заливають підігрітою (40-50 град. C) водопровідною водою з
розрахунку 1 куб. дм води на 300-500 г фаршу. Температура повинна
бути 40 град. C. Додають 1% хімічно чистої соляної кислоти (питома
вага 1,19). Масу добре перемішують і ставлять в термостат на
15-18 годин (або більше) при 37-40 град. C, або при 42-45 град. C
на 18 годин (або більше). Під час процесу переварювання бутель
струшують, спочатку через 1-1,5 годин, потім рідше. В добре
перевареному пептоні на дні бутля лежить невеликий шар дрібного
темного осаду.
Повноту осадження баластних білків перевіряють шляхом
додавання до 5 куб. см профільтрованого пептону 1-2 крапель 10%
NaOH. При цьому не повинна з'являтися каламуть.
Надосадову рідину обережно зливають, прогрівають при
80 град. C протягом 10 хвилин для зупинення дії ферментів.
Стерилізують текучою парою 30 хвилин, зберігають в сухому
прохолодному місці. Використовують не раніше ніж через 5 діб після
приготування.
М'ясна вода подвійної концентрації
Знежирене, звільнене від сухожиль м'ясо середньої
вгодованості пропускають через м'ясорубку, заливають гарячою водою
в пропорції 1 куб. дм води на 1 кг фаршу і залишають на ніч в
холодильнику при 6 +- 2 град. C, вранці суміш кип'ятять протягом
15-20 хвилин з моменту закипання. Готовий настій фільтрують, фарш
віджимають, одержану м'ясну воду розливають в стерильні бутлі по
250-500 куб. см і стерилізують при 121 +- 1 град. C протягом
20 хвилин.
Паперові смужки з індикатором крезоловий червоний
0,1 г крезолового червоного розчиняють в 100 куб. см
96 град. C етанолу, залишають при 37 +- 1 град. C на 24 години,
часто струшуючи. Наступного дня змочують в цьому розчині смужки
фільтрувального паперу і швидко висушують. Яскраво-жовтий колір
папірців у лужному середовищі переходить в різні відтінки
червоного.
7.4. Середовища для визначення біохімічних властивостей
Середовище Пізу для визначення ферменту
цистинази на мартенівському агарі
До 90 куб. см розплавленого 1,5% мартенівського агару (агар
Хоттінгера не допускається!), pH - 7,6, додають 2 куб. см 1%
розчину цистину, виготовленого на 0,1 N розчині H SO (або HCl),
2 4
ретельно перемішують і додають такий же об'єм 0,1 N розчину NaOH
для нейтралізації відповідної кількості кислоти. Розчини кислот і
лугів повинні бути взаємно відтитровані, можна використовувати
стандартні фіксанали. Розливають у флакони. Стерилізують при
температурі 112 +- 1 град. C 30 хвилин.
Агар з цистином розплавляють при 90 град. (не кип'ятіть!) для
збереження цистину. До охолодженого до 40-45 град. C середовища
асептично додають 1 куб. см 10% розчину оцтовокислого свинцю і
9 куб. см сироватки. Розливають в аглютинаційні пробірки
стовпчиком висотою 3, краще 4 см.
Пам'ятати! При 50 град. C сироватка в присутності
оцтовокислого свинцю згортається і середовище набуває молочного
кольору, що ускладнює облік реакції.
Середовище Пізу для визначення ферменту цистинази
(модифікація Ю.М.Фельдмана)
В 90 куб. см дистильованої води розчинити 3 г сухого
поживного агару (краще агару "Д" або еритритагару) і прокип'ятити.
Наважка сухого поживного агару розраховується, виходячи з пропису
на етикетці, щоб його густина складала 1,5 %. Додати 2 куб. см
1,5% розчину цистину в 0,1 N розчині HCl з наступним підведенням
pH середовища до 7,6 2 куб. см 0,1 N розчину NaOH (як вказано
вище). Мутні або забарвлені серії агару не використовують.
Середовище стерилізують 10-15 хвилин при 112 +- 1 град. C.
До розплавленого і охолодженого до 40-45 град. C середовища
додають 1 куб. см 10% розчину оцтовокислого свинцю, 2 куб. см
стерильного 10% розчину гіпосульфіту натрію, 10 куб. см сироватки.
Розливають, як в попередньому рецепті.
Пам'ятати! Розчини 10% оцтовокислого свинцю і 10%
гіпосульфіту натрію готують ex tempore, використовуючи стерильні
пробірки і дистильовану воду, стерилізують текучою парою або на
водяній бані при 80-90 град. C 30 хвилин.
Середовища для визначення ферменту уреази
Бульйон з сечовиною. До 100 куб. см стерильного
м'ясо-пептонного або бульйону Хоттінгера (pH 7,0) додають 1 г
сечовини і 0,2 куб. см 1,6% спиртового розчину індикатора
крезолрот. Розливають над полум'ям по 2-3 куб. см в стерильні
пробірки і стерилізують текучою парою протягом 10 хвилин.
Метод Заксе. Готується 2 реактиви: A і B.
РЕАКТИВ A:
Сечовина - 2 г.
96 град. етиловий спирт - 2 куб. см.
Дистильована вода - 4 куб. см.
РЕАКТИВ B:
0,2 % розчин фенолрот - 1 куб. см,
Однозаміщений фосфат калію (KH PO ) - 0,1 г.
2 4
Двозаміщений фосфат калію (K HPO ) - 0,1 г.
2 4
Хлористий натрій (NaCl) - 0,5 г.
Дистильована вода - 100 куб. см.
Реактив A не стерилізують і зберігають при температурі від
6 +- 2 град. C. Реактив B стерилізують в автоклаві текучою парою.
Середовище для відновлення нітратів в нітрити
До 100 куб. см поживного бульйону pH 7,3-7,5, вільному від
нітритів (перевірити реактивом Грісса або Касаткіна), додають
0,1% вільної від нітритів калійної селітри (0,1 г KNO ),
3
перевіривши ще раз на вміст нітритів, розливають по 5 куб. см в
промиті дистильованою водою не менше як 5 разів пробірки.
Стерилізують 15 хвилин при 121 +- 1 град. C.
Реактив Грісса
Розчин N 1 - 0,8% сульфанілова кислота в 5 N оцтовій кислоті.
Розчин N 2 - 0,6% диметилальфанафтамін в 5 N оцтовій кислоті.
Перед проведенням реакції змішують рівні об'єми розчинів N 1 і
N 2.
Пам'ятати! Реактив придатний для користування протягом
15 хв., безколірний, при появі рожевого забарвлення не
використовувати.
Реактив Касаткіна
Розчин N 1 - 0,1 %-й розчин риванолу в дистильованій воді.
Розчин N 2 - 12 %-й розчин соляної кислоти (HCl).
Перед виконанням реакції змішують рівні об'єми розчинів N 1
та N 2. Реактивна суміш придатна для використання протягом 15
хвилин.
Приготування дисків для визначення нітрат-редуктази
Використовується 5% розчин нітрату натрію (NaNO ) на
3
дистильованій воді. Нітрат натрію і дистильована вода не повинні
вміщувати нітрити (перевірити реактивом Грісса). Стерильні смужки
фільтрувального паперу просочуються 5% розчином нітрату натрію у
стерильній чашці Петрі і підсушуються 24 години.
7.5. Середовища для вивчення
сахаролітичних властивостей
До 100 куб. см гарячої дистильованої води послідовно додають
1 г пептону, 0,5 г NaCl, 0,1 куб. сміндикатора Андреде.
Встановлюють pH - 7,4, кип'ятять 5 хвилин, фільтрують через
паперовий або полотняний фільтр, доводять до попереднього об'єму
гарячою дистильованою водою. До одержаної основи додають один з
перелічених вуглеводів (сахароза, глюкоза) в кількості 1-0,5 г,
крохмаль (розчинний) - 0,5 г.
Середовища розливають у пробірки по 2-3 куб. см, стерилізують
при 112 +- 1 град. C 20 хвилин. Готові середовища з індикатором
Андреде безбарвні або мають ледь рожевуватий відтінок.
Приготування дисків з крохмалем
Хроматографічний фільтрувальний папір нарізають смужками
шириною 1 см, стерилізують 20 хвилин при 121 +- 1 град. C,
висушують в сушильній шафі, просочують розчином крохмалю з
індикатором в стерильній чашці Петрі, висушують в сушильній шафі
при температурі 50-60 град. C і нарізають квадрати розміром
1 х 1 см. Зберігають у пеніцилінових флаконах або пробірках.
Розчин крохмалю з індикатором: до 8 куб. см 1% пептонної води
з pH - 7,2 додають 1 г розчинного крохмалю та 2 куб. см 0,4%
розчину фенолового червоного. Розчиняють на водяній бані при
нагріванні до 90 град. при постійному помішуванні.
Індикатор Андреде
До 100 куб. см дистильованої води додають: 0,5 г кислого
фуксину, 16,4 куб. см 4% розчину NaOH. Розчин на добу ставлять в
термостат при 37 +- 1 град. C, періодично струшують, 2 доби
витримують на світлі і після цього ховають в темне місце. Щойно
приготований індикатор має солом'яно-жовтий колір або злегка
рожевуватий відтінок, який зникає в процесі зберігання. Інтенсивно
рожевий колір вказує на необхідність збільшення лугу при
приготуванні до 18 куб. см.
Посуд повинен бути сухим, хімічно чистим, з темного скла, з
притертою пробкою!
Приготування і стерилізація тампонів
Для приготування тампонів використовують дерев'яні або
металеві палички (для транспортного середовища - з металу, що не
окислюється), на один з кінців яких щільно накручують шар
гігроскопічної вати (приблизно 120 мг). Тампони монтують в
пробірки з корковими або ватними пробками так, щоб тампон не
торкався дна пробірки. Стерилізувати в сушильній шафі при
температурі 140-150 град. C протягом години або в автоклаві при
температурі 112 +- 1 град. C протягом 30 хвилин.
Приготування тампонів, змочених 5% розчином гліцерину
При транспортуванні на великі відстані можна використовувати
тампони, попередньо змочені 5% розчином гліцерину (5% розчин
гліцерину готують на фізіологічному розчині, pH доводять до 7,6 за
допомогою 20% розчину Na HPO ). Тампони змочують із спільного
2 3
флакону з гліцерином, занурюючи тампон і відтиснувши зайву рідину
об стінки флакона. Стерилізують в автоклаві при температурі
112 град. протягом 30 хвилин.
8. Контроль поживних середовищ
Кожна партія приготованого середовища для первинного посіву
матеріалу, визначення токсигенності, біохімічних і сахаролітичних
властивостей, особливо при використанні нових поживних основ
(промислового чи лабораторного виробництва) або нових
інгредієнтів, підлягає бактеріологічному контролю через можливу
нестандартність. Перелік штамів для контролю поживних середовищ
надано в додатку 2.
Усі штами, що використовують для перевірки поживних середовищ
повинні мати паспорти і підтвердження лабораторії вищого рівня.
Важливим моментом є попередній контроль основи середовищ на
вміст амінного азоту.
8.1. Контроль якості кров'яно-телуритових середовищ
встановлюють шляхом визначення:
а) ростових властивостей середовища;
б) інгібуючої активності відносно супутньої флори;
в) часу формування колоній.
При цьому використовують контрольний токсигенний штам або
місцеві свіжовиділені токсигенні культури коринебактерій дифтерії
з типовими культурально-морфологічними властивостями. Оцінка
інгібуючої активності здійснюється за допомогою штаму S.aureus.
Культури C.diphtheriae і S.aureus (18-20 годинного росту),
вирощені на сироватковому агарі, змивають фізіологічним розчином,
підводять під оптичний стандарт мутності 10 од. - умовно 1 млрд.
бактеріальних клітин в 1 куб. см суспензії. З вихідної стандартної
суспензії в стерильних пробірках готують 10-кратні розведення
(див. таблицю), ретельно перемішуючи і міняючи стерильну піпетку
після кожного "кроку".
З 6-го і 7-го розведень по 0,1 куб. см суспензії
C.diphtheriae (відповідно 500 і 100 мікр. кл.) вносять в 2 добре
підсушені чашки з середовищем, насухо розтирають шпателем (для
кожної чашки новий шпатель). На 2 інші чашки з середовищем таким
же способом висівають S.aureus. Облік результатів здійснюють через
24-48 годин. Середовище визнається придатним для використання,
якщо колонії C.diphtheriae формуються на поверхні досліджуваного
середовища через 24 години інкубації у вигляді ізольованих
колоній. При посіві 100 мікробних клітин - не менше 3-5 колоній
C.diphtheriae та відсутності росту S.aureus на всіх засіяних
чашках. При відсутності росту C.diphtheriae у посіві 500 і
100 м. кл. дослід необхідно повторити. Якщо результат буде такий
же, середовище для роботи не придатне.
Схема приготування розведень культур
C.diphtheriae і S.aureus
------------------------------------------------------------------
| N | Кількість |Об'єм культури, що вноситься| Кількість |
|пробірки| (куб. см) | | мікробів |
| |фізіологічного| | |
| | розчину | | |
|--------+--------------+----------------------------+-----------|
| 1 | 1,0 | 1,0 куб. см вихідної | 500000000 |
| | | суспензії | |
|--------+--------------+----------------------------+-----------|
| 2 | 4,5 | 0,5 з 1-ї пробірки | 50000000 |
|--------+--------------+----------------------------+-----------|
| 3 | 4,5 | 0,5 з 2-ї пробірки | 5000000 |
|--------+--------------+----------------------------+-----------|
| 4 | 4,5 | 0,5 з 3-ї пробірки | 500000 |
|--------+--------------+----------------------------+-----------|
| 5 | 4,5 | 0,5 з 4-ї пробірки | 50000 |
|--------+--------------+----------------------------+-----------|
| 6 | 4,5 | 0,5 з 5-ї пробірки | 5000 |
|--------+--------------+----------------------------+-----------|
| 7 | 2,0 | 0,5 з 6-ї пробірки | 1000 |
------------------------------------------------------------------
Вихідне розведення - 1 млрд. мікробних тіл в 1 куб. см
9
фізіологічного розчину (1 х 10 ).
8.2. Контроль середовищ для визначення токсигенності
C.diphtheriae
Контроль середовищ для визначення токсигенності здійснюється
шляхом випробування контрольним дифтерійним штамом, дотримуючись
всіх етапів методики визначення токсигенних властивостей.
Критеріями оцінки якості середовища є наявність преципітатів і час
їх утворення. Придатними для роботи вважають ті серії середовища,
при використанні яких у токсигенного штаму інтенсивні преципітати
утворюються через 18-24 години після посіву "бляшками". Середовища
(чи нові інгредієнти) не можна використовувати у випадку
відсутності преципітатів або при їх появі у пізніші терміни.
8.3. Контроль середовищ для визначення біохімічних
властивостей здійснюють шляхом визначення ступеня виразності і
часу формування даної ознаки. В середовище Пізу, бульйон з
сечовиною (або реактиви A і B), в середовища Гісса засівають
петлею контрольні штами.
Зберігання штамів в умовах лабораторії
Контрольний токсигенний штам, та інші тест-штами одержують в
УЦДСЕН або обласних СЕС. Штами повинні зберігатися відповідно
вимогам Положення про порядок обліку, зберігання, обороту,
відпуску та пересилки культур бактерій, вірусів, рикетсій, грибів,
найпростіших, мікоплазм, бактерійних токсинів, отрут біологічного
походження, затвердженого МОЗ СРСР 18.05.79.
Зберігати штами, в тому числі контрольний, можна:
а) на 10% сироватковому агарі при 6 +- 2 град. C (пересів
кожні 14 днів);
б) в 0,1% напіврідкому сироватковому агарі, приготованому на
мартенівському або іншому бульйоні (pH - 7,6) в холодильнику
(пересів 1 раз в 2-3 місяці). Напіврідкий агар розливають по 8
куб. см в пробірки, в кожну додають по 0,5 куб. см кінської або
1,0 куб. см сироватки ВРХ. Якщо зберігати під шаром стерильного
вазелінового масла, то пересів можна проводити 1 раз в 3 місяці.
в) в мартенівському бульйоні (pH - 7,6), під стерильним
вазеліновим маслом (пересів кожні 3 місяці).
Контрольний токсигенний штам необхідно періодично засівати на
кров'яний агар.
Примітка. Використання виробничого штаму PW8 та його
варіантів забороняється.
Методика кількісного визначення амінного азоту
Принцип методу базується на блокуванні аміногруп
формальдегідом при pH - 7,0 і титруванні лугом еквівалентної
кількості карбоксильних груп. Початок і кінець титрування
визначають потенціометрично.
Реактиви: 1. Їдкий натр 0,1 N розчин.
2. Соляна кислота 0,1 N розчин.
3. Формалін (10% розчин формальдегіду).
Перед кожним визначенням pH формаліну доводять до 7,0.
Хід визначення. Для аналізу використовують певний об'єм "В"
рідкого зразка. "В" рівне:
- 3 куб. см для рідких гідролізатів низького ступеню
розщеплення (0,1-0,2% амінного азоту);
- 1 куб. см - середнього ступеню розщеплення (0,3-0,6%
амінного азоту);
- 0,5 куб. см високого ступеню розщеплення (0,7-1,3% амінного
азоту);
- 3 куб. см для рідких поживних середовищ (0,1-0,2% амінного
азоту);
- 10 куб. см для рідких екстрактів (0,1-0,2% амінного азоту).
В стакан місткістю 50 куб. см наливають об'єм "В"
аналізованого розчину і доводять загальний об'єм дистильованою
водою до 20 куб. см. Електроди потенціометра занурюють у
досліджуваний розчин, pH якого доводять до 7,0 з допомогою 0,1
N розчину NaOH або 0,1 N розчину HCl. Під час визначення електроди
повинні залишатись зануреними у розчин. До нейтралізованого
розчину додають 2 куб. см нейтрального формаліну, перемішують і,
не виймаючи електродів, титрують вміст 0,1 N розчином їдкого натру
до pH - 9,1. Для титрування належить використовувати мікробюретку
на 5 куб. см.
Вміст амінного азоту в досліджуваному зразку в % (Х)
розраховують за формулою:
А х К х 1,4 х 100
Х = -------------------, де
В х 1000
А - кількість 0,1 N розчину NaOH в куб. см, використаного для
титрування досліджуваної проби;
К - поправка до титру 0,1 N розчину NaOH;
1,4 - кількість амінного азоту в мг, еквівалентна 1 куб. см
0,1 N розчину NaOH;
100 - коефіцієнт перерахунку в %;
В - кількість рідкого зразка в куб. см, взята для аналізу;
1000 - коефіцієнт перерахунку мг в г.
9. Рецепти фарб
1. Лужна метиленова синька Лефлера:
Дистильована вода - 99 куб. см,
1% розчин їдкого калію (КОН) - 1 куб. см.
Профільтрований спиртовий розчин метиленового синього.
(3 г метиленового синього на 30 куб. см спирту) - 30 куб. см.
Фарбувати протягом 1-2 хвилин.
2. Оцтовокислий толуїдиновий синій
Толуїдиновий синій - 0,25-0,5 г.
Льодяна оцтова кислота - 2 куб. см.
96 град. етиловий спирт - 5 куб. см.
Дистильована вода - 10 куб. см.
Фарбувати протягом 3-5 хвилин.
3. Метил-віолет або кристал-віолет:
Метил-віолет або кристал-віолет - 0,25 г.
5% розчин оцтової кислоти - 100 куб. см.
Профільтрувати. Фарбувати протягом 5-10 хвилин.
4. Катіонний синій - О (бентіазоловий барвник)
5. Метиленовий блакитний технічний (тіазиновий барвник)
Для 4 і 5 барвників рецепт приготування однаковий:
Дистильована вода - 100 куб. см.
Профільтрований спиртовий розчин 4-го і 5-го барвника (1 г
барвника на 10 куб. см спирту, витриманий в термостаті при 37 +- 1
град. C протягом доби).
Фарбувати протягом 1-3 хвилин.
Авторами інструкції є: Т.Г.Глушкевич, Н.М.Жеребко,
В.В.Томчук, Л.М.Стратієнко (Український Центр державного
санітарно-епідеміологічного нагляду МОЗ України). О.А.Гладка,
(Львівській НДІ епідеміології та гігієни). О.В.Деміховська
(Київській НДІ епідеміології і інфекційних хвороб), Ю.М.Фельдман,
Л.В.Маханьова (Житомирська обласна дитяча лікарня).
При підготовці інструкції використані матеріали "Инструкции
по бактериологической и серологической индикации возбудителя
дифтерии и его токсина" - додаток 5 до наказу МОЗ СРСР від
02.04.86 N 450 "О мерах по предупреждению заболеваемости
дифтерией"; "Методических рекомендаций по применению
модифицированной среды Пизу и индикаторных бумажных дисков для
идентификации, биохимического типирования и определения
токсигенности дифтерийных микробов" МОЗ СРСР N 28-6/31;
"Руководства по лабораторной диагностике дифтерии" ВООЗ,
Копенгаген, 1994. Clinical Microbiology of Coryneform Bacteria.
Clinical Microbiology Reviews. Jan. 1997. p. 125-159.
Додаток 1
ТЕРМІНИ ТА УМОВИ
зберігання діагностичних препаратів,
поживних середовищ, їх компонентів,
фарб та індикаторів
------------------------------------------------------------------
| N | Найменування поживного середовища | Термін та умови |
| | або компоненту | зберігання |
|---+--------------------------------------+---------------------|
| 1 | Мартенівський пептон | Кімнатна температура|
|---+--------------------------------------+---------------------|
| 2 | М'ясна вода подвійної концентрації | При температурі |
| | | 6 +- 2 град. C |
|---+--------------------------------------+---------------------|
| 3 | Основи для кров'яного і кров'яно- | 2 місяці, |
| | телуритового агарів | при температурі |
| | | 6 +- 2 град. C |
|---+--------------------------------------+---------------------|
| 4 | Кров'яно-телуритова суміш | 2 місяці, |
| | | при температурі |
| | | 6 +- 2 град. C |
|---+--------------------------------------+---------------------|
| 5 | Кров'яний агар | 3 доби |
| | | при температурі |
| | | 6 +- 2 град. C |
|---+--------------------------------------+---------------------|
| 6 | Кров'яно-телуритові середовища | 3 доби, |
| | | при температурі |
| | | 6 +- 2 град. C |
|---+--------------------------------------+---------------------|
| 7 | Основи для транспортних середовищ | 1 місяць |
| | | при температурі |
| | | 6 +- 2 град. C, |
| | | 10 діб при |
| | |кімнатній температурі|
|---+--------------------------------------+---------------------|
| 8 | Готове транспортне середовище | 10 діб |
| | | при 6 +- 2 град. C, |
| | | 3 доби при кімнатній|
| | | температурі |
|---+--------------------------------------+---------------------|
| 9 | Сироватковий агар | 2 тижні, |
| | | при температурі |
| | | 6 +- 2 град. C |
|---+--------------------------------------+---------------------|
|10 | Середовища для визначення | 1 доба |
| | токсигенності (чашки) | при температурі |
| | | 6 +- 2 град. C |
|---+--------------------------------------+---------------------|
|11 | Основа середовища Пізу | 1 місяць |
| | | при температурі |
| | | 6 +- 2 град. C |
|---+--------------------------------------+---------------------|
|12 | Середовище Пізу | Свіжого приготування|
|---+--------------------------------------+---------------------|
|13 | Телурит калію 2 % | 4 роки в ампулах |
|---+--------------------------------------+---------------------|
|14 | Середовища з вуглеводами | перевірка 1 раз |
| | | на місяць |
|---+--------------------------------------+---------------------|
|15 | Реактив Грісса (р-ни N 1 і N 2) | 2 місяці |
| | | при температурі |
| | | 6 +- 2 град. C |
|---+--------------------------------------+---------------------|
|16 | Реактив Касаткіна (р-ни N 1 і N 2) | 2 місяці |
| | | при температурі |
| | | 6 +- 2 град. C |
|---+--------------------------------------+---------------------|
|17 | Реактив Грісса (суміш р-нів) | 15 хвилин |
|---+--------------------------------------+---------------------|
|18 | Реактив Касаткіна (суміш р-нів) | 15 хвилин |
|---+--------------------------------------+---------------------|
|19 | Реактив A для визначення уреази за | при температурі |
| | методом Заксе | 6 +- 2 град. C |
|---+--------------------------------------+---------------------|
|20 | Дифтерійний антитоксин (розчин) | до 7 діб |
| | | при температурі |
| | | 6 +- 2 град. C |
|---+--------------------------------------+---------------------|
|21 | Агар для визначення токсигенних | 2 тижні, |
| | властивостей з середовищем 199 | при температурі |
| | | 6 +- 2 град. C |
|---+--------------------------------------+---------------------|
|22 | Фарби (готові) | 1 місяць |
| | | у темному місці |
| | | у флаконах із |
| | | темного скла |
|---+--------------------------------------+---------------------|
|23 | Диски з вуглеводами | 1 рік |
| | | при температурі |
| | | 6 +- 2 град. C |
|---+--------------------------------------+---------------------|
|24 | Смужки фільтрувального паперу для | в стерильній |
| | визначення токсигенності | чашці Петрі до |
| | | 3 тижнів при |
| | |кімнатній температурі|
------------------------------------------------------------------
Додаток 2
Тест-штами для контролю поживних середовищ
--------------------------------------------------------------------------------------------------
| N | Назва середовища | Термін | Тест-штам | Результат |
|п/п| | контролю | |--------------------------------------|
| | | | | позитивний | негативний |
| | | | | контроль | контроль |
|---+---------------------+----------+--------------------+-------------------+------------------|
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
|---+---------------------+----------+--------------------+-------------------+------------------|
| 1 | Кров'яно-телуритовий| 24 | C.diphtheriae | При засіві 100 | |
| | агар | години | | мікробних клітин | |
| | | | | не < 3 - 5 КУО | |
| | | |--------------------+-------------------+------------------|
| | | | S.aureus | | Відсутність росту|
| | | | | | при висіві 6 та 7|
| | | | | | розведень |
|---+---------------------+----------+--------------------+-------------------+------------------|
| 2 | Середовища та | 18-24 | C.diphtheriae tox+,| Лінії преципітації| |
| | компоненти для | години | NCTC 10648 | | |
| | визначення |----------+--------------------+-------------------+------------------|
| | токсигенності | 48 годин | C.diphtheriae tox-,| | Відсутність ліній|
| | | | NCTC 10356 | | преципітації |
|---+---------------------+----------+--------------------+-------------------+------------------|
| 3 | Середовища для | 6-24 | C.diphtheriae | Почорніння по | |
| | визначення | години | | ходу уколу, | |
| | цистинази | | | "хмаринка" | |
| | | |--------------------+-------------------+------------------|
| | | | C.xerosis | | Відсутність |
| | | | | | почорніння |
|---+---------------------+----------+--------------------+-------------------+------------------|
| 4 | Визначення уреази | 30 хв. | C.pseudo- | Почервоніння | |
| | за методом Заксе | | diphtheriticum | середовища | |
| | | |--------------------+-------------------+------------------|
| | | | C.diphtheriae | | Відсутність |
| | | | | | почервоніння |
| |---------------------+----------+--------------------+-------------------+------------------|
| | бульйон з | 18-24 | C.pseudo- | Почервоніння | |
| | сечовиною | години | diphtheriticum | середовища | |
| | | |--------------------+-------------------+------------------|
| | | | C.diphtheriae | | Відсутність |
| | | | | | почервоніння |
|---+---------------------+----------+--------------------+-------------------+------------------|
| 5 | Нітратний бульйон | 24 | C.diphtheriae | Почервоніння | |
| | | години | | середовища при | |
| | | | | додаванні | |
| | | | | реактиву Грісса | |
| | | |--------------------+-------------------+------------------|
| | | | | |Колір |
| | | | E.coli | |не змінюється |
| | | | | |при додаванні |
| | | | | |реактиву Грісса |
|---+---------------------+----------+--------------------+-------------------+------------------|
| 6 | Середовище з | 18-24 | C.diphtheriae | Почервоніння | |
| | глюкозою | години | | середовища | |
| | | |--------------------+-------------------+------------------|
| | | | C.pseudodiph | | Відсутність |
| | | | theriticum | | почервоніння |
|---+---------------------+----------+--------------------+-------------------+------------------|
| 7 | Середовище з | 18-24 | C.xerosis | Почервоніння | |
| | сахарозою | години | | середовища | |
| | | |--------------------+-------------------+------------------|
| | | | C.diphtheriae | | Відсутність |
| | | | | | почервоніння |
|---+---------------------+----------+--------------------+-------------------+------------------|
| 8 | Середовище з | 18-24 | C.diphtheriae | Почервоніння | |
| | крохмалем | години | gravis | середовища | |
| | | |--------------------+-------------------+------------------|
| | | | C.diphtheriae | | Відсутність |
| | | | mitis | | почервоніння |
--------------------------------------------------------------------------------------------------
Додаток 3
ПЕРЕЛІК
імунобіологічних препаратів
для діагностики дифтерії, що зареєстровані
і дозволені для використання в Україні
---------------------------------------------------------------------------
| Назва | Оригінальна назва | Дата | Строк дії |
| | | реєстрації | реєстрації |
|--------------------------+--------------------+------------+------------|
| 1 | 2 | 3 | 4 |
|-------------------------------------------------------------------------|
| Державне експериментальне підприємство |
| медичних препаратів ІБОНХ НАН, Україна |
|-------------------------------------------------------------------------|
|Поживне середовище для | АГВ | 20.01.99 | 20.01.2004 |
|визначення чутливості | | | |
|мікробів до антибіотиків, | | | |
|сухе | | | |
|--------------------------+--------------------+------------+------------|
|Поживний агар для | | 20.01.99 | 20.01.2004 |
|визначення токсигенності | | | |
|дифтерійних мікробів, | | | |
|сухий | | | |
|--------------------------+--------------------+------------+------------|
|Поживне середовище для | Еритрит агар | 20.01.99 | 20.01.2004 |
|виділення та культивування| | | |
|бруцел, сухе | | | |
|--------------------------+--------------------+------------+------------|
|Поживний агар для |М'ясо-пептонний агар| 06.03.98 | 06.03.2003 |
|культивування | | | |
|мікроорганізмів, сухий | | | |
|--------------------------+--------------------+------------+------------|
|Поживний бульйон для | | 06.03.98 | 06.03.2003 |
|культивування | | | |
|мікроорганізмів, сухий | | | |
|-------------------------------------------------------------------------|
| ГНЦ прикладної мікробіології |
| (відділення "Питательные среды"), Росія |
|-------------------------------------------------------------------------|
|Середовище для визначення | Коринетоксагар | 29.12.98 | 29.12.2003 |
|токсигенності дифтерійних | | | |
|мікробів, сухе | | | |
|--------------------------+--------------------+------------+------------|
|Поживне середовище для | Коринебакагар | 29.12.98 | 29.12.2003 |
|виділення коринебактерій | | | |
|--------------------------+--------------------+------------+------------|
|Поживний агар для | ГРМ-агар | 29.12.98 | 29.12.2003 |
|культивування | | | |
|мікроорганізмів, сухий | | | |
|-------------------------------------------------------------------------|
| ЗАТ "Біолік", Україна |
|-------------------------------------------------------------------------|
|Поживний агар для |М'ясо-пептонний агар| 13.03.98 | 13.03.2003 |
|культивування | | | |
|мікроорганізмів, сухий | | | |
|--------------------------+--------------------+------------+------------|
|Поживний бульйон для | М'ясо-пептонний | 13.03.98 | 13.03.2003 |
|культивування | бульйон | | |
|мікроорганізмів, рідкій | | | |
|--------------------------+--------------------+------------+------------|
|Сироватка кінська | | | |
|нормальна для | | 13.03.98 | 13.03.2003 |
|бактеріологічних поживних | | | |
|середовищ | | | |
|-------------------------------------------------------------------------|
| ЗАТ "БіоТоп", Україна |
|-------------------------------------------------------------------------|
|Сироватка діагностична | | | |
|антитоксична кінська рідка| | 13.03.98 | 13.03.2003 |
|для імунопреципітації | | | |
|-------------------------------------------------------------------------|
| Технологічний інститут м'яса та молока УААН, Україна |
|-------------------------------------------------------------------------|
|Поживний агар для | | 21.01.99 | 21.01.2004 |
|культивування | | | |
|мікроорганізмів, сухий | | | |
|--------------------------+--------------------+------------+------------|
|Поживний бульйон для | | 21.01.99 | 21.01.2004 |
|культивування | | | |
|мікроорганізмів, сухий | | | |
---------------------------------------------------------------------------
ЗАТВЕРДЖЕНО
Наказ МОЗ України
03.08.1999 N 192
ПОЛОЖЕННЯ
про центральну референс-лабораторію МОЗ України з
діагностики дифтерії
Функції Центральної референс-лабораторії МОЗ України з
діагностики дифтерії (далі Центральна референс-лабораторія)
покладаються на бактеріологічну лабораторію Українського центру
держсанепіднагляду МОЗ України, що входить до мережі лабораторій,
що співробітничають з ВООЗ з питань діагностики дифтерії.
Керівником Центральної референс-лабораторії є завідуючий
бактеріологічною лабораторією.
За матеріально-технічне забезпечення Центральної
референс-лабораторії несе відповідальність головний лікар
Українського центру держсанепіднагляду.
Центральна референс-лабораторія здійснює спостереження за
етіологічною структурою дифтерійної інфекції, циркуляцією
збудників дифтерії серед населення з метою прогнозування та
зниження захворюваності на дифтерію, удосконалення профілактичних
і протиепідемічних заходів.
1. Завдання Центральної референс-лабораторії
МОЗ України з діагностики дифтерії
1.1. Методичне керівництво і практична допомога мережі
лабораторій установ охорони здоров'я з питань бактеріологічної
діагностики дифтерії.
1.2. Аналіз матеріалів державної статистичної та галузевої
звітності, інформацій, що надходять до МОЗ України та УЦДСЕН від
установ охорони здоров'я щодо об'єму, структури та результатів
бактеріологічних досліджень на дифтерію.
1.3. Проведення консультацій щодо методів бактеріологічної
діагностики дифтерійної інфекції, включаючи ідентифікацію штамів
коринебактерій, що мають відхилення від типових властивостей.
1.4. Збір і вивчення біологічних властивостей збудників
дифтерії, що циркулюють на території країни.
1.5. Створення Національної колекції збудників дифтерії, що
циркулюють на території країни.
1.6. Розробка, апробація і впровадження в практику нових
методів дослідження, ідентифікації та індикації збудників
дифтерії.
1.7. Підготовка для установ охорони здоров'я інформаційних
матеріалів з питань етіологічної структури, методів дослідження та
сучасних досягнень в галузі бактеріологічної діагностики
дифтерійної інфекції.
1.8. Організація підготовки лікарів бактеріологів з питань
сучасних методів лабораторної діагностики дифтерії.
1.9. Організація контролю якості бактеріологічних досліджень
на дифтерію шляхом "сліпого тестування". Ідентифікація атипових
штамів коринебактерій, що важко діагностуються, та підтвердження
виділених культур.
1.10. Участь в системі міжнародного контролю якості
досліджень на дифтерію, що проводиться Центральною
референс-лабораторією ВООЗ з дифтерії.
1.11. Співробітництво з науково-дослідними інститутами країни
та у встановленому порядку з Центральною референс-лабораторією
ВООЗ й іншими регіональними центрами з дифтерії.
1.12. Участь в міжнародних програмах по мікробіологічному
контролю за дифтерією в Європі.
2. Права Центральної референс-лабораторії
МОЗ України з діагностики дифтерії
Центральній референс-лабораторїї з діагностики дифтерії
надається право:
2.1. Користуватися інформацією, що надходить до МОЗ України
та УЦДСЕН від установ охорони здоров'я, що необхідна для аналізу
етіологічної структури, біологічних особливостей коринебактерій, а
також для оцінки ефективності профілактичних, протиепідемічних
заходів, лабораторних досліджень при дифтерійній інфекції.
2.2. Одержувати від установ охорони здоров'я культури
коринебактерій, відповідно до Положення про порядок обліку,
зберігання, обороту, відпуску та пересилки культур бактерій,
вірусів, рикетсій, грибів, найпростіших, мікоплазм, бактерійних
токсинів, отрут біологічного походження, затвердженого МОЗ СРСР
18.05.79.
2.3. Вносити на розгляд Міністерства охорони здоров'я
пропозиції з питань поліпшення лабораторної діагностики дифтерії.
2.4. Перевіряти якість роботи лабораторій установ охорони
здоров'я системи МОЗ України з лабораторної діагностики дифтерії.
2.5. Брати участь у роботі по підвищенню кваліфікації
фахівців лабораторій з розділу "Бактеріологічна діагностика
дифтерії".
2.6. Брати участь у підготовці та виданні матеріалів
наукового, інформаційного, методичного та просвітницького
спрямування з питань лабораторної діагностики дифтерії,
етіологічної структури дифтерійної інфекції та циркуляції
збудників серед населення.
2.7. Брати участь в системі міжнародного контролю якості
досліджень на дифтерію, що проводиться Центральною
референс-лабораторією ВООЗ з дифтерії.
2.8. Співпрацювати з науково-дослідними інститутами країни та
у встановленому порядку з Центральною референс-лабораторією ВООЗ й
іншими регіональними центрами з дифтерії.
2.9. Брати участь в міжнародних програмах по
мікробіологічному контролю за дифтерією в Європі.
2.10. Брати участь в організації та проведенні
науково-практичних конференцій, з'їздів, семінарів, нарад стосовно
лабораторної діагностики дифтерії.
2.11. Користуватися для службового листування бланками з
назвою лабораторії.
