Преаналитический этап при вирусологических исследованиях

Вы здесь

Правила сбора биологического материала для вирусологических исследований и его транспортировка в микробиологические лаборатории регламентирована действующими нормативными документами.

Сбор материала следует проводить как можно раньше, при появлении первых симптомов болезни, так как период вирусовыделения при многих острых инфекциях ограничен несколькими днями (3-5 сут). Сбор материала при аутопсии необходимо осуществлять по возможности в самые ранние сроки после смерти пациента.

Все пробы должны быть получены с соблюдением правил асептики. Взятие клинического материала выполняют стерильными одноразовыми инструментами. Работу следует проводить в стерильных одноразовых перчатках. Каждый образец помещают в отдельный стерильный одноразовый флакон или в контейнер с завинчивающейся крышкой. Могут быть использованы стерильные конические центрифужные пробирки с плотно закрывающимися пробками. Объем пробирки должен быть достаточным для внесения 1-5 мл транспортной среды.

Клинический материал для ПЦР-диагностики необходимо забирать в пробирки с транспортной средой (если таковая необходима), предоставляемой фирмой- производителем тест-систем или реагентов. Для сбора пробы зондом-тампоном используют стерильные тампоны (вискозные или дакроновые) на пластиковой или алюминиевой основе. Не допускается применение тампонов с алгинатом кальция и деревянной осью. Жидкость везикул аспирируют туберкулиновыми шприцами.

Кровь собирают в стерильные одноразовые или стеклянные пробирки с антикоагулянтом (гепарином, ЭДТА, цитратом натрия). Сразу после взятия необходимо плотно закрыть флаконы, пробирки, контейнеры с биоматериалом, не касаясь их внутренней поверхности и внутренней поверхности крышек, не допуская зазора и смятия внутренней части крышки.

Пробы биологического материала следует доставить в лабораторию незамедлительно; если такая возможность отсутствует, должно быть обеспечено хранение биоматериала в холодильнике. Температура хранения определяется видом биоматериала. Транспортировку проб, хранившихся при температуре менее 0 °С, осуществляют в термоконтейнерах, исключающих оттаивание биологического материала; охлаждающие элементы перед транспортировкой клинического материала следует замооаживать до нужной температуры.

При переносе клинического материала из пробирок, флаконов, контейнеров в новые необходимо использовать отдельные одноразовые стерильные наконечники с аэрозольными барьерами. Открывая флаконы, пробирки, контейнеры в процессе работы, нельзя выполнять резких движений во избежание разбрызгивания и расплескивания клинического материала, что может привести к контаминации проб и рабочих поверхностей.

Для детекции нуклеиновых кислот вирусов следует использовать следующие образцы биологического материала; кровь, мочу, отделяемое уретры и урогенитального тракта, фекалии, цереброспинальную, слезную жидкость, отделяемое конъюнктивы и т.д. Эти же разновидности образцов могут быть использованы для выделения вирусов.

Проба	Вирусы-возбудители
Кровь цельная	ВИЧ, герпес-вирусы 1, 2, 3, 4, 5. 6-го типов, парвовирус В19, энтеровирусы
Кровь периферическая (клетки)	ВИЧ, герпес вирусы 1,2 3, 4, 5, 6-го типов, парвовирус В19, энтеровирусы
Кровь периферическая (плазма)	Герпес-вирусы 3, 4, 5-го типов, вирусы гепатитов А, В, С, D, Е, G, ККГЛ, краснухи, парвовирус В19, энтеровирусы
Кровь пуповииная	Герпес-вирусы 1, 2, 3, 5, 6-го типов, вирус краснухи, парвовирус В19
Соскоб из цервикального канала	Герпес-вирусы 1, 2, 5-го типов, вирус папилломы человека
Соскоб из уретры	Герпес-вирусы 1, 2, 5-го типов
Соскоб из эрозивно-язвенных элементов	Герпес-вирусы 1, 2, 3-го типов
Моча	Аденовирус, герпес-вирусы 1, 2, 5-го типов, вирус краснухи, полиови- рус, вирус эпидемического паротита
Амниотическая жидкость	Герпес-вирусы 1, 2,3,4, 5, 6-го типов, вирус краснухи, парвовирус В19
Бронхоальвеолярный лаваж	Герпес-вирус 6-го типа
Мазок из носоглотки	Аденовирус, вирусы гриппа А, В, краснухи, парагриппа 1, 2, 3-го типов, респираторно-синцитиальный вирус
Мазок из ротоглотки	Аденовирус, герпес-вирусы 1. 2,4, 6-го типов, вирусы гриппа А, В, краснухи, парвовирус В19, вирусы парагриппа "М-го типа, респираторно-синцитиальный вирус, SARS
Мокрота	Герпес-вирус 5-го типа, вирусы гриппа А, В, парагриппа 1, 2, 3-го типов, респираторно-синцитиальный вирус
Отделяемое конъюнктивы	Аденовирус
Плацента	Герпес-вирусы 3, 4, 5, 6-го типов, краснухи, парвовирус В19
Слюна	Аденовирус, вирус бешенства, герпес-вирусы 1, 2, 3,4, 5, 6-го типов, вирус краснухи, парвовирус В19, вирус эпидемического паротита, SARS
Спинномозговая жидкость	Герпес-вирусы 1, 2, 3, 4, 5, 6-го типов, вирусы краснухи, клещевого энцефалита, парвовирус В19, энтеровирусы, вирус эпидемического паротита
Фекалии	Аденовирус группы F, вирус гриппа H5N1, астровирус, норавирус, ротавирус, флавивирус, энтеровирусы, SARS
Аутопсийный материал	Астровирус, вирусы гриппа А, В, HINisw, H5N1, герпес-вирусы 1, 2, 3, 4, 5, 6-го типов, вирус краснухи, ККГЛ, парвовирус В19, норавирус, ротавирус Флавивирус, энтеровирусы, вирус клещевого энцефалита, SARS

Кровь

Взятие крови следует проводить натощак или через 3 ч после приема пищи из локтевой вены одноразовой иглой (диаметром 0,8-1,1 мм) в специальную вакуумную систему с 6% ЭДТА. После взятия крови пробирку следует несколько раз плавно перевернуть для перемешивания пробы с антикоагулянтом и промаркировать.

Предобработка. Плазму крови следует получать центрифугированием пробирок с цельной кровью при 3000 об./мин (800-1600 g) в течение 20 мин при комнатной температуре. После центрифугирования, используя наконечники с аэрозольным барьером, необходимо отобрать не менее 1 мл плазмы в стерильные пробирки типа «Эппендорф» на 2 мл.

Клетки крови (лейкоцитарную фракцию цельной крови) следует отбирать после центрифугирования цельной крови и удаления плазмы. С помощью наконечников с аэрозольным барьером собирают лейкоцитарную массу с поверхности осадка клеток в объеме 0,2 мл и переносят в стерильную пробирку типа «Эппендорф».

Условия хранения. Образцы цельной крови хранят при температуре:

20-25 °С — не более 6 ч с момента получения материала для количественного, в течение 12 ч — для качественного определения нуклеиновых кислот:

2-8 °С — не более одних суток как для качественного, так и для количественного определения нуклеиновых кислот.

Замораживание образцов цельной крови недопустимо.

Образцы плазмы крови можно сохранять при температуре 2-8 °С в течение 5 сут, -16...-20 °С — в течение года.

Допускается однократное замораживание-оттаивание материала. Образцы, предназначенные для длительного хранения, необходимо квотировать в отдельные стерильные пробирки.

Транспортировка. Осуществляют в специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом.

Образцы крови транспортируют при температуре 2-8 °С в течение 6 ч с момента взятия материала для количественного; 12 ч — для качественного определения нуклеиновых кислот.

Образцы плазмы транспортируют при температуре 2-8 °С в течение 3 сут, в замороженном виде — в течение 1 сут.

Материал из урогенитального тракта женщин

Материал следует получать из нескольких точек: эпителия цервикального канала (эндоцервикса), вагинального отделяемого; при необходимости — из уретры и эрозивно-язвенных поражений.

Перед забором материала необходимо удалить слизь с поверхности шейки матки стерильным тампоном. Соскоб эпителия проводят отдельными для каждой локализации одноразовыми стерильными цервикальными цитощетками или универсальными зондами. Рабочую часть цитощетки с собранным материалом следует обломить в области насечки и оставить в пробирке.

Отделяемое уретры получают с помощью универсального зонда. Рабочую часть зонда с собранным материалом следует обломить в области насечки и оставить в пробирке.

Материал из разных локализаций помещают в отдельные пробирки с транспортной средой. Для скрининга и диагностики папилломавирусной инфекции материал собирают с помощью комбинированного цервикального зонда для одновременного взятия материала из эндо- и экзоцервикса. Во всех случаях допустимо присутствие примесей в виде слизи и крови.

Пробирки необходимо промаркировать.

Предобработка. Образцы, взятые в транспортную среду, тщательно перемешивают на вортексе до полного растворения слизи и образования гомогенной суспензии клеток.

Образцы соскоба эпителия из эндо- и экзоцервикса, взятые в пробирку с транспортной средой, следует тщательно перемешать на вортексе для растворения слизи и получения однородной суспензии; затем, используя наконечник с аэрозольным барьером, отобрать 0,5 мл образца, перенести в пробирку типа «Эппендорф», центрифугировать при 10-12 тыс. об./мин в течение 5 мин, удалить 0,4 мл надо- садочной жидкости, осадок перемешать с 0,1 мл оставшейся жидкости.

Условия хранения. Клинический материал из урогенитального тракта хранят при температуре 18-25 °С в течение 48 ч, 2-8 °С — в течение 14 сут, -70 °С — длительно. Допускается однократное замораживание-оттаивание материала.

Транспортировка. Осуществляют в специальном контейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом при температуре 2-8 °С в течение 5 сут, в замороженном виде — в течение 1 сут.

Материал из урогенитального тракта мужчин

Перед взятием материала следует обработать головку полового члена в области наружного отверстия уретры тампоном, смоченным стерильным физиологическим раствором. Отделяемое уретры получают с помощью специального зонда, который вводят на глубину 1-2 см и несколькими вращательными движениями проводят соскоб эпителиальных клеток. Зонд переносят в пробирку со специальной транспортной средой, обламывают рабочую часть в области насечки и оставляют в пробирке. Допустимо присутствие примесей в виде слизи, крови и гноя.

Предобработка. Образцы, взятые в транспортную среду, необходимо тщательно перемешать на вортексе до полного растворения слизи и получения гомогенной суспензии клеток.

Условия хранения. Клинический материал из урогенитального тракта хранят при температуре 18-25 °С в течение 48 ч, 2-8 °С — в течение 14 сут.

Транспортировка. Осуществляют в специальном контейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом при температуре 2-8 °С в течение 5 сут, в замороженном виде — в течение 1 сут.

Моча

Забирают первую порцию утренней мочи в количестве 20-30 мл в специальный сухой стерильный флакон объемом 50 мл с крышкой, маркируют.

Условия хранения. Нативные пробы мочи хранят при температуре 18-25 °С в течение 6 ч, 2-8 °С — в течение 1 сут, предварительно обработанные образны мочи — при температуре 2-8 °С в течение 1 сут, -20 °С — в течение 7 сут, -70 °С — длительно. Допускается однократное замораживание-оттаивание проб.

Транспортировка. Осуществляют в специальном контейнере с охлаждающими элементами при температуре 2-8 °С в течение 1 сут, в замороженном виде — в течение 1 сут.

Фекалии

Пробы отбирают из предварительно продезинфицированной емкости, из нескольких мест, одноразовой лопаткой, прикрепленной к крышке флакона для забора материала, маркируют.

Предобработка. Для получения осветленного экстракта фекалий используют нативные образцы водянистой консистенции или свежеприготовленную суспензию, или суспензию, подвергнутую замораживанию с глицерином.

Приготовление фекальной суспензии осуществляют следующим образом. В центрифужные пробирки (объемом 1,5 мл) типа «Эппендорф», соответствующие количеству образцов фекалий, вносят по 0,8 мл стерильного физиологического раствора, после чего отдельными одноразовыми наконечниками (или одноразовыми лопатками) в каждую пробирку добавляют по 0,1 мл образца и тщательно перемешивают на вортексе до образования гомогенной суспензии. Ее осветляют центрифугированием при 12 000 об./мин (10 000 g) в течение 5 мин. Супернатант отбирают в отдельную емкость, смешивают с равным объемом отрицательного контрольного образца и используют для выделения нуклеиновых кислот.

Суспензию фекалий с глицерином готовят при необходимости длительного хранения материала. Для этого к 10-20% суспензии фекалий добавляют глицерин до конечной концентрации 10-15%, тщательно гомогенизируют на вортексе и после экспозиции с глицерином в течение 40 мин пробы замораживают.

Условия хранения. Пробы фекалий хранят при температуре 18-25 °С в течение 6 ч, 2-8 °С — в течение 3 сут.

Фекальную суспензию с глицерином и осветленный фекальный экстракт хранят при температуре -20 °С в течение 7 сут, при температуре -70 °С — длительно.

Транспортировка

Осуществляют в специальном контейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом.

Образцы нативных фекалий транспортируют при температуре 2-8 °С в течение 6 ч.

Фекальную суспензию с глицерином и осветленный фекальный экстракт транспортируют в замороженном состоянии в течение 1 сут,

Спинномозговая жидкость

Спинномозговую жидкость забирают с помощью одноразовых игл в одноразовые пластиковые сухие пробирки в количестве не менее 1 мл. Пробирки маркируют.

Предобработка. Спинномозговую жидкость центрифугируют для концентрирования содержащих вирусы клеток. Осадок и 100 мкл супернатанта используют для выделения нуклеиновых кислот.

Условия хранения. Пробы спинномозговой жидкости хранят при температуре 18-25 “С в течение 6 ч, 2 -8 °С — в течение 1 сут. -20 °С — в течение 30 сут, -70 °С — длительно. Допускается однократное замораживание-оттаивание проб.

Транспортировка. Осуществляют в специальном контейнере с охлаждающими элементами при температуре 2-8 °С в течение 6 ч, в замороженном виде — в течение 1 сут.

Слезная жидкость

Материал объемом не менее 0,5 мл забирают с помощью одноразовых пластиковых пипеток в одноразовые сухие стерильные пластиковые пробирки (например, «Эппендорф»). Для усиления слезотечения проводят провокацию слезоточивым веществом (например, нашатырным спиртом). Пробирки с материалом маркируют.

Условия хранения. Пробы слезной жидкости хранят при температуре 18-25 °С в течение 6 ч, 2-8 °С - в течение 1 сут, -20 °С — в течение 7 сут, -70 °С — длительно. Допускается однократное замораживание-оттаивание проб.

Отделяемое конъюнктивы

Материал получают под местной анестезией (2 капли раствора дикаина) с помощью зонда с сухим стерильным ватным тампоном. Оттягивая нижнее веко, проводят несколько раз по конъюнктиве, захватывая внешний и внутренний углы глаза. Материал помещают в специальную пробирку с транспортной средой; нижнюю, рабочую часть зонда обламывают, оставляя ее в пробирке. Пробы маркируют.

Условия хранения. Пробы отделяемого конъюнктивы хранят при температуре 18-25 °С в течение 6 ч, 2-8 °С — в течение 3 сут.

Транспортировка. Осуществляют в специальном контейнере с охлаждающими элементами при температуре 2-8 °С в течение 6 ч.

Замороженный клинический материал транспортируют в специальном контейнере с сухим льдом в течение 1 сут.

Мазки со слизистой оболочки полости носа

Отделяемое со слизистой оболочки полости носа следует забирать сухим стерильным ватным тампоном на пластиковой основе. Тампон вводят по наружной стенке носа на глубину 2-3 см до нижней носовой раковины. После этого тампон слегка опускают, вводят в нижний носовой ход, делают вращательное движение и удаляют вдоль наружной стенки носа. Далее, погрузив рабочую часть зонда в транспортную среду, помещенную в стерильную одноразовую пробирку типа «Эппендорф», обламывают стержень, оставляя рабочую часть зонда в пробирке. Пробы маркируют.

Условия хранения. Мазки со слизистой оболочки полости носа хранят при температуре 18-25 X в течение 6 ч, 2-8 °С — в течение 3 сут. При необходимости более длительного хранения температура не должна превышать -16 °С.

Транспортировка. Осуществляют в специальном контейнере с охлаждающими элементами при температуре 2-8 °С в течение 1 сут. Замороженный клинический материал транспортируют в специальном контейнере с сухим льдом в течение 1 сут.

Смывы из полости носа

Взятие материала осуществляют в положении больного сидя, с отклоненной назад головой. В оба носовых хода с помощью одноразового шприца вводят по 5 мл стерильного физиологического раствора. Промывную жидкость из обоих носовых ходов собирают через стерильную воронку в одну стерильную емкость. Пробы маркируют.

Условия хранения. Смывы из полости носа хранят при температуре 2-8 °С в течение 6 ч, -20 °С — в течение 7 сут, -70 °С — длительно.

Транспортировка. Осуществляют в специальном контейнере с охлаждающими элементами при темпера туре 2-8 °С в течение 6 ч, в замороженном виде — в течение 1 сут.

Мазки из ротоглотки

Отделяемое забирают сухим стерильным ватным тампоном на пластиковой основе, делая вращательные движения по поверхности миндалин, небных дужек, задней стенки ротоглотки. Далее, погрузив рабочую часть зонда в транспортную среду, помещенную в стерильную одноразовую пробирку типа «Эппендорф», обламывают стержень, оставляя рабочую часть зонда в пробирке. Пробы маркируют.

Условия хранения. Мазки из ротоглотки хранят при температуре 18-25 °С в течение 6 ч, 2-8 °С — в течение 3 сут. При необходимости более длительного хранения температура не должна превышать -16 °С.

Смывы из ротоглотки

Предварительно больной прополаскивает полость рта водой. После этого проводит тщательное повторное полоскание с помощью 10 мл физиологического раствора в течение 10-15 с. Жидкость собирают в стерильный флакон. Пробу маркируют.

Условия хранения. Смывы из ротоглотки хранят при температуре 18-25 °С в течение 6 ч, 2-8 °С — в течение 3 сут. При необходимости более длительного хранения температура не должна превышать -16 “С.

Транспортировка. Осуществляют в специальном контейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом при температуре 2-8 °С в течение 6 ч, в замороженном виде — в течение 1 сут.

Мокрота

Забирают в количестве не менее 1 мл в одноразовые стерильные флаконы с широким горлом и завинчивающейся крышкой. Пробы маркируют

Условия хранения. Пробы мокроты хранят при температуре 18-25 °С в течение 6 ч, 2-8 °С — в течение 3 сут. При необходимости более длительного хранения температура не должна превышать -16 °С.

Слюна

Предварительно больной троекратно прополаскивает полость рта физиологическим раствором. Слюну в количестве не менее 1 мл собирают в сухие стерильные одноразовые пробирки с завинчивающейся крышкой. Пробы маркируют.

Условия хранения. Пробы слюны хранят при температуре 18-25 °С в течение 6 ч, 2 -8 °С — в течение 1 сут.

Бронхоальвеолярный лаваж, или промывные воды бронхов

Взятие материала проводят в одноразовые, плотно завинчивающиеся пробирки объемом 50 мл. Пробы маркируют.

Условия хранения. Предварительно обработанные пробы хранят при температуре 2-8 °С в течение 1 сут, -20 °С — в течение 7 сут, -70 °С — длительно.

Биопсийный и аутопсийный материал

Материал следует забирать из зоны предполагаемого местонахождения возбудителя инфекции, поврежденной ткани или из пограничной с поврежденным участком зоны.

Кусочки ткани диаметром не более 5 мм помещают в одноразовые стерильные пробирки типа «Эппендорф», содержащие 0,5 мл специальной транспортной среды. Пробирки маркируют.

Условия хранения Предварительно обработанные пробы хранят при температуре 18-25 °С в течение 6 ч, 2-8 °С — в течение 3 сут. При необходимости более длительного хранения температура не должна превышать -16 °С

Замороженный клинический материал транспортируют в специальном контейнере с сухим льдом в течение 1 сут (только для материала, подозрительного на наличие ДНК-содержащих вирусов).