Эякулят - Определение количественных и качественных особенностей сперматозоидов

Определение подвижности сперматозоидов.

Кинезисграмма - это процентное соотношение в эякуляте сперматозоидов с различной подвижностью. Количество подвижных сперматозоидов является главным критерием при оценке их полноценности. С помощью окошка Фонио подсчитывают в нативном препарате 100 сперматозоидов, отмечая количество с нормальной подвижностью (нормокиноспермия), с ослабленной (гипокиноспермия) и неподвижных (акиноспермия).

Количество сперматозоидов с нормальной подвижностью (поступательными движениями со скоростью 50 мкм/с) в норме составляет 80-90 %, с ослабленной (медленными поступательными движениями) - 10-12 %, неподвижных - 6-10 %.

Наличие у сперматозоидов колебательных движений - дискиноспермия в норме не наблюдается.

Динамическая кинезисграмма.

Для получения динамической кинезисграммы в течение 24 ч определяют процент подвижных сперматозоидов через определенные промежутки времени. Нормальное количество сперматозоидов и нормальная кинезисграмма при низких показателях динамической кинезисграммы свидетельствуют о слабой оплодотворяющей способности (астеноспермия).

Каплю спермы наносят на покровное стекло, переворачивают его и кладут на предметное стекло с луночкой для висячей капли таким образом, чтобы капля оказалась в центре углубления. Края покровного стекла смазывают вазелином и под микроскопом определяют процент нормо-, гипо- ,и акиноспермии через 3, 6, 12 и 24 ч после эякуляции. Исследование проводят при комнатной температуре. В норме через каждые 3 ч нормокиноспермия уменьшается на 20 %.

Проба на «оживление» сперматозоидов.

При акиноспермии в свежем эякуляте свыше 30 % возможно нарушение оплодотворяющей способности, но только при условии невозможности «оживить» сперматозоиды. Безуспешность попытки «оживления» свидетельствует о некроспермии неподвижных сперматозоидов. В качестве стимулирующих («оживляющих») растворов можно использовать следующие:

1) раствор Бекера: глюкоза - 3 г, Na₂HP0₄ - 0,6 г, NaCl - 0,2 г, КН₂Р0₄ - 0,01 г, дистиллированная вода - до 100 мл (pH 7,8);

2) 0,1 % раствор кофеина (нельзя пользоваться кофеином в ампулах);

3) 0,1 М раствор аргинина и др.

Пробу на «оживление» необходимо проводить параллельно с любыми двумя из указанных стимулирующими растворами.

Мерной пипеткой емкостью 1 мл насасывают 0,1 мл спермы (хорошо перемешанной), после чего этой же пипеткой набирают 0,9 мл любого стимулирующего раствора. Выдувают содержимое пипетки на часовое стекло, тщательно перемешивают, готовят препараты висячей капли для определения динамической кинезисграммы и исследуют их под микроскопом. Через 5- 10 мин неподвижные, но живые сперматозоиды начинают двигаться. Процент подвижных сперматозоидов определяют в течение 24 ч через каждые 2-3 ч.

Окраска по Блуму.

Позволяет отличить погибшие сперматозоиды от живых, находящихся в состоянии акинезии. Для этой цели на предметное стекло наносят маленькую каплю спермы, рядом с ней помещают вдвое большую каплю 5 % раствора эозина, и каплю 10 % водного раствора нигрозина, вдвое большую, чем капля эозина. Сначала сперму стеклянной палочкой смешивают с эозином и несколько секунд выжидают, затем смешивают с каплей нигрозина, опять несколько секунд выжидают. После чего шлифованным стеклом делают тонкий мазок (так же, как мазок крови). Живые сперматозоиды при этом остаются неокрашенными, а погибшие окрашиваются в розовый цвет. Можно окрашивать сперму только эозином, но при окраске нигрозином морфология сперматозоидов выражена более отчетливо. Мазок высушивают и исследуют в иммерсионной системе микроскопа. Сосчитывают 500 клеток и определяют процентное содержание живых и погибших сперматозоидов. В норме живые сперматозоиды составляют 80-90 % их общего количества.

Подсчет сперматозоидов в 1 мл и во всем объеме эякулята.

Количество сперматозоидов в эякуляте подсчитывают в счетной камере Горяева. Тщательно перемешанную сперму набирают в меланжер для лейкоцитов до метки 0,5 (разведение в 20 раз), затем до метки 11 набирают жидкость для разведения и заполняют камеру Горяева.

Для разведения спермы используется любая из следующих жидкостей: раствор гидрокарбоната натрия: гидрокарбонат натрия - 5 мл, концентрированный формалин - 1 мл, дистиллированная вода - 100 мл (можно готовить без двууглекислого натра, который добавляется для растворения слизи); 2) жидкость Рубенкова: основной фуксин- 0,1 г, краситель Романовского - 0,02 мл, концентрированная карболовая кислота- 0,2 мл, глицерин -0,1 мл, этиловый спирт ректификат - 2 мл, 1 % натрия хлорид- 100 мл. Преимущества жидкости Рубенкова заключаются в том, что она окрашивает сперматозоиды. Это, наряду с подсчетом общего количества сперматозоидов, позволяет определять сперматограмму. Используя окуляр 7Х и объектив 40X, подсчитывают все сперматозоиды в пяти больших квадратах, расположенных по диагонали (считают только те сперматозоиды, головки, которых лежат внутри квадрата) и умножают на 1 000 000. Полученное число соответствует количеству сперматозоидов в 1 мл исследуемой спермы. Для подсчета сперматозоидов в счетной камере Горяева можно использовать и пробирочный метод.

Количество сперматозоидов во всем эякуляте определяют путем умножения числа сперматозоидов в 1 мл на объем эякулята (в мл). В норме количество сперматозоидов в эякуляте превышает 150 млн.

Методом подсчета в камере Горяева можно определить число подвижных сперматозоидов. Для этого сперму разводят теплым изотоническим раствором натрия хлорида и подсчитывают в камере только неподвижные сперматозоиды, а затем из общего количества сперматозоидов вычитают количество неподвижных.

В норме в 1 мл спермы содержится 60- 120 млн. сперматозоидов, при гиперспермии - более 120 млн., при олигоспермии - от 30 до 60 млн.

Для определения истинного числа сперматозоидов при олигоспермии необходимы

2-3 контрольных подсчета с интервалом

3-4 недели. У одного и того же мужчины число сперматозоидов подвержено большим физиологическим колебаниям.

Определение сперматограммы.

Сперматограмма - это совокупность результатов количественного исследования спермы. Для определения сперматограммы препараты окрашивают по Паппенгейму или гематоксилин-эозином и подсчитывают с иммерсионной системой микроскопа не менее 200 сперматозоидов. При этом можно использовать машинку для подсчета лейкограммы. В нормальной сперме сперматозоиды нормальной формы составляют 80-85 %, в их число входят физиологические варианты, которые характеризуются или необычно суженной, или уменьшенной, или увеличенной головкой. Молодые, или незрелые, формы сперматозоидов имеют вокруг головки и шейки остаток цитоплазмы (воротничок»), наблюдаются при частых половых сношениях и не способны к оплодотворению. Старые формы сперматозоидов характеризуются гиперхромией, ахромией или вакуолизацией головки, появляются в сперме после продолжительного полового воздержания и непригодны для оплодотворения.

К дегенеративным (патологическим) формам относят сперматозоиды с деформациями головки: мегалосперматозоиды (гигантосперматозоиды), сперматозоиды с двумя головками, но с одной шейкой и одним хвостом, а также без шейки с одним или несколькими хвостами, без хвоста, с хвостом без головки и др.

У здоровых мужчин с нормальной спермой патологические формы сперматозоидов обычно не встречаются, но иногда их количество при нормальной плодовитости может достигать 20 %, из них приблизительно 15 % составляет патология головки, 3-5 % - тела и 2-5 % - хвоста.

При патологическом сперматогенезе и секреторном бесплодии обнаруживаются сперматозоиды преимущественно с патологией головки и шейки. Патология хвоста обычно экскреторного происхождения, возникает при прохождении сперматозоидов по патологически измененным семявыносящим путям. В нормальной сперматограмме клетки сперматогенеза составляют 0,5-2 %.

Для фазовоконтрастнок микроскопии сперму разводят изотоническим раствором хлорида натрия с добавлением небольшого количества 1 % водного раствора риванола или карболовой кислоты для уменьшения подвижности сперматозоидов.

При люминесцентной микроскопии с использованием в качестве флюорохрома акридинового оранжевого в разведении 1 : 20 000 в нативной сперме легко дифференцируются живые, окрашенные в зеленый цвет, и погибшие, окрашенные в оранжевый цвет, сперматозоиды. Различить нормальные и патологические формы сперматозоидов вследствие их морфологических особенностей легко.

Правила работы на фазовоконтрастном и люминесцентном микроскопах описаны в инструкциях к этим приборам. Морфологические формы сперматозоидов при фазовоконтрастной и люминесцентной микроскопии учитывают таким же образом, как и при обычной световой микроскопии.

Руководство к практическим занятиям по клинической лабораторной диагностике / Под ред. проф. М.А. Базарновой, проф. В.Т. Морозовой.— К.: Выща школа, 1988.— 318 с., 212 ил.